源于原始生殖细胞的人、小鼠ES细胞的分离克隆

摘 要 本研究探讨不同的饲养层、胎龄、细胞因子及添加物对小鼠胚胎源ES细胞和PGCs源人、小鼠胚胎干细胞分离克隆的影响，得到早期传代的人、小鼠类ES细胞。 1．MEF、bEF、hEF三种饲养层细胞对小鼠胚胎（囊胚）贴壁率和ICM扩增率分别为91.5%a、76.2%b、64.2%c；74.8%a;、69.8%b'、38.47%c'，各组间差异显著（除a'∶b'，P>0.05，其余P<0.05）。同源MEF饲养层细胞最有利于小鼠胚胎源ES细胞的分离培养。 2．自9.5-13.5dpc小鼠胎儿PGCs可以获得早期传代类ES的胞系。7.5-8.5及14.5-15.5dpc小鼠胎儿原代培养观察到类ES细胞集落，16.5-18.5dpc小鼠胎儿原代培养未观察到类ES细胞。 3．总共收集分离流产儿136例，其中110例4-13W胎儿中56例观察到类ES细胞集落。39例做传代培养，H58传至9代，7例传至5代以上。 4．自4-13W流产儿PGCs均可分离到人类ES细胞。5-10W流产儿最适于PGCs源的人类ES细胞的分离克隆，5W以下或大于17W流产儿难于得到PGCs源的人类ES细胞。 5．添加LIF（4ng/ml）+bFGF(4ng/ml)+SCF(20ng/ml)及谷氨酰胺（2mM），丙酮酸钠（1mM）、非必需氨基酸有利于PGCs源的人ES细胞的分离克隆。 6．MEF、bEF、hEF三种饲养层细胞对人PGCs体外培养均有促进作用。MEF最适于人PGCs的体外培养，hEF对PGCs培养效果稍差于MEF。 7．本研究早期传代PGCs源人、小鼠类ES细胞具典型小鼠ES细胞特征，核较大,细胞呈集落生长，典型集落呈鸟巢样集落，集落结构紧密，细胞间界限不清隆起，与周边细胞界限清晰；表现AKP阳性；悬浮培养或延迟传代培养能分化形成类胚体或上皮样细胞，成纤维细胞，神经样细胞，观察到PGCs分化成的心肌样跳动的细胞团，收缩频率60-120次/min，最长连续跳动10d；H53、H62、H78部分冷冻细胞解冻后能重新形成类ES细胞集落。多项实验证明，本研究得到早期传代的PGCs源的小鼠、人类ES细胞。