保肺方对肺间质纤维化大鼠模型细胞外基质代谢影响的实验研究

特发性肺间质纤维化（IPF）是一种原因不明，以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱并最终导致肺间质纤维化为特征的疾病。IPF确切发病率尚不清，约为3～5/10万人，且近年来发病率有增高趋势，其平均5年存活率与肺癌相似。直至今日，IPF治疗尚无特效药物，传统的糖皮质激素和细胞毒药物疗效不能令人满意。因此，肺纤维化已成为临床治疗的难点，寻找行之有效的治疗药物是目前医学界迫切需要解决的问题。 IPF过程中细胞外基质（ECM）合成和降解的失衡，可导致ECM某些成分在肺内过度沉积，肺纤维化形成。故调节ECM的代谢失衡状态，进而减少其在间质中的沉积，可起到减缓和遏制肺纤维化发展的作用。中医理论则认为肺纤维化的病位在肺而与多脏相关；在其病机发展中，虚（气阴两虚）和瘀（瘀血痰浊）贯穿于始终，且随着疾病的进展，病初在气，久则深及血络。 本课题即针对肺纤维化ECM代谢失衡的病理状态，分为7、14及28天三个时间点动态观察了肺纤维化过程中ECM的变化及中医证候学特点的演变情况，观察了以益肺肾、化痰瘀、通肺络为法的导师经验方“保肺方”对气管内灌注博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型的影响。 实验研究分为五个部分： 1保肺方对肺纤维化大鼠模型病理形态学、肺功能及肺组织羟脯氨酸含量影响的研究 通过对模型动物一般状况的观察（如体重、活动、呼吸等），对肺指数、肺功能及肺组织羟脯氨酸的测定及病理形态学研究（HE染色、MASSON染色），观察保肺方对肺纤维化模型大鼠的影响。 结果显示，模型大鼠体重下降、活动减少、肺功能各项指标降低，肺指数增加，结合HE染色可见各时期均有不同程度的肺泡炎、MASSON染色可见肺间质胶原沉积等，表明博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型复制成功，出现了类似人类肺纤维化的表现。肺纤维化大鼠经保肺方治疗后，体重逐渐增加、肺功能指标逐步好转，肺组织羟脯氨酸含量明显下降，病理形态显示肺泡炎及纤维化程度明显改善。图像分析结果显示，治疗后肺泡腔面积较疗前明显增加，肺泡炎及纤维化面积明显减少。 结果提示，经保肺方治疗后上述指标可有效地得到改善，保肺方能从功能与结构两方面减轻IPF的异常改变。 2保肺方对肺纤维化大鼠模型中医证候学影响的研究 通过对模型大鼠呼吸频率、温水游泳时间及血液流变学指标（全血粘度和血浆粘度）的测定，观察肺纤维化过程中的中医证候学特点及保肺方对其的影响。 结果显示，(1) 肺纤维化模型大鼠呼吸急促，呼吸频率较正常组明显增加；全血粘度、血浆粘度在各个时间点较正常组均有不同程度的升高；肺纤维化大鼠温水游泳时间较正常组明显减少，运动耐力明显下降。(2)经保肺方治疗后，肺纤维化大鼠呼吸频率明显下降，全血粘度和血浆粘度明显降低，温水游泳时间明显延长；经强的松治疗后模型大鼠血液粘度明显升高，与正常组之间有显著性差异。 结果提示，肺纤维化大鼠出现了气虚血瘀的证候变化，且肺纤维化中气虚、血瘀并不是 独立存在的，而是相互影响，相合致病的。保肺方重视整体调节，其治则兼顾正邪两面，体现了对病本（气和阴）的保护，及对邪（瘀）的祛除，能有效地改善肺纤维化气虚血瘀的病理状态。 3保肺方对肺纤维化大鼠模型支气管肺泡灌洗液（BALF）及血清中透明质酸（HA）、层粘连蛋白（LN）影响的研究 采用放射免疫分析法，对BALF及血清中的LN、HA进行测定，并通过观察保肺方对二者的影响，从细胞外基质角度来探讨其作用机制所在。 结果显示，(1)肺纤维化模型大鼠各时间点BALF中LN含量明显较正常组高，呈递增趋势。血清中LN含量也持续升高，且与BALF中LN的升高趋势相一致，二者呈正相关。模型组BALF中HA含量7天显著高于正常组，但呈下降趋势。血清中HA含量亦较正常组有所增加，但各组间比较无显著差异。(2) 肺纤维化大鼠经保肺方与强的松治疗后，BALF及血清中LN含量均明显低于同期模型组，且保肺方作用较激素持久。BFF及强的松治疗后BALF中HA含量较同期模型组降低，且保肺方的此种作用一直持续到肺纤维化期，作用优于激素。 结果提示（1）BFF可能通过降低肺纤维化大鼠BALF及血清中HA和LN的水平，一方面减轻或抑制了肺泡炎及肺纤维化的发生发展；另一方面起到了保护基底膜的作用，从而使衰弱的肺气得以恢复。（2）保肺方不仅仅是作用在肺局部（BALF中），还可通过全身的代谢进行调节（血清水平），显示了中医药标本同治、整体调节、宏观调控的优势。 4保肺方对肺纤维化大鼠模型肺组织TGF-β1蛋白表达影响的研究 采用免疫组织化学染色的方法结合图像半定量分析技术，对肺组织中TGFβ1的表达情况进行观察，从细胞因子的角度进一步探讨保肺方对肺纤维化细胞外基质代谢作用的机制所在。 结果显示，肺纤维化模型大鼠肺组织TGF-β1蛋白表达7、14天强度明显高于正常组，至28天降至与正常组无显著差异。经保肺方和强的松治疗后，其表达强度较模型组明显减弱，14天已降至正常水平。 结果提示，TGF-β1参与了肺纤维化全过程，并在此过程中发挥了重要作用。保肺方可能通过降低肺纤维化大鼠肺组织中TGF-β1的含量或降低其活性，而抑制了TGF-β1对细胞外基质沉积的促进作用，减