性激素对女性膀胱出口梗阻影响的研究

研究背景 女性膀胱出口梗阻（female bladder outlet obstruction，fBOO）是一组由不同原因、不同发病机制所引起的膀胱出口梗阻综合征。由于尿流动力学的发展和尿道膀胱镜的广泛应用，使fBOO的早期诊断已成为可能。fBOO在临床上主要表现为：尿频、排尿困难、淋漓不尽、排尿时间延长等，多有反复尿路感染史，部分患者尚可表现为非感染性的慢性盆腔疼痛，是围绝经期及绝经后妇女常见的下尿路疾病，严重影响了妇女的身心健康。目前临床上研究较多的是原发性膀胱颈梗阻（primary bladder neck obstruction，PBNO），典型的PBNO患者除了膀胱镜检查可以见到膀胱颈抬高以外，常无其他的特殊发现。梗阻早期典型的尿动力学检查表现为正常或偏高的逼尿肌收缩，而尿流率低下。继发性膀胱出口梗阻由于有明确的继发因素，在原发疾病解除后，膀胱颈梗阻状况多能得到缓解或消失，故临床不做为研究的重点。 fBOO虽然是女性围绝经期前后的常见病，但能真正得到临床医生的重视却只在近几年。导致fBOO的发病原因及机制目前尚缺乏系统的认识，限制了临床上fBOO的预防和治疗。基于患者膀胱镜下可见到膀胱颈口抬高，临床上对于无明显下尿路症状者多采取期待疗法或药物治疗，出现典型下尿路梗阻症状者则多采取经尿道膀胱颈口切开术。然而，并非所有患者在术后排尿梗阻情况均能得到缓解。而且绝经后妇女尿道粘膜和阴道壁粘膜明显变薄，在行膀胱颈口切开术时有发生尿瘘等严重并发症的可能。对这些患者，临床进一步的处理常常显得较为困难。 由于fBOO患者多发生于围绝经期，绝经后症状多加重。推测围绝经期性激素平衡的失调参与了fBOO的发生。但临床上也发现，并非所有的妇女在围绝经期均会出现下尿路症状，在围绝经期出现典型下尿路症状的妇女行膀胱镜及尿动力学检查也并非均会有膀胱颈抬高现象及排尿梗阻状况。由此推测，这些人群可能具有不同的性激素水平特征，临床在经验性的激素替代治疗时要充分考虑到激素的剂量与种类问题。目前，大量的研究实验已证明，性激素水平与膀胱结构和功能关系密切。但在围绝经期及绝经后妇女，性激素在体内和体外研究中的各自独立的影响机制及它们之间的相互作用仍有待进一步探讨。 目前，有关fBOO患者的生殖激素水平特征国内外尚未见报道，这可能与fBOO是否做为一种独立的女性下尿路疾病在临床上还存在争议有关。本研究分两部分：第一部分、临床研究；采用放射免疫法（RIA）分别测定围绝经期有典型下尿路症状妇女的性激素水平，包括膀胱镜检查及尿动力学检查证实有膀胱出口梗阻存在的fBOO患者和无膀胱出口梗阻患者（without bladder outlet obstruction，nBOO）以及正常育龄期妇女体内的性激素水平，包括雌激素（estrogen，E）、雄激素（testosterone，T）、孕激素（progensterone，P）、卵泡刺激素（follicular stimulating hormone，FSH）和黄体生成素（luteal hormone，LH），了解各组间性激素水平特点。同时采用免疫组化（Envision法）比较3组妇女膀胱颈口和膀胱三角区部位组织的雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progensterone receptor，PR）、雄激素受体（androgen receptor，AR）的表达，通过对上述各项指标的分析比较，明确各激素与膀胱出口梗阻发生的相关性，并揭示其作用机理。第二部分、动物实验；对卵巢切除后大鼠补充不同种类及剂量的性激素，了解各激素对膀胱结构和功能的影响，为临床fBOO的治疗和预防提供理论依据。 第一部分围绝经期女性膀胱出口梗阻的性激素水平及受体在膀胱壁的表达 【研究目的】 为了了解性激素对fBOO的影响，我们比较了围绝经期fBOO者、nBOO者及正常育龄妇女的性激素水平特点，并采用免疫组化分别比较膀胱颈口及膀胱三角区部位的ER、PR、AR的表达，明确其相关性，并初步揭示其作用机理。 【材料与方法】 本研究根据研究对象的纳入标准选择了68例有典型下尿路症状的围绝经期妇女：年龄45岁—55岁之间；洁尿培养阴性；无急、慢性器质性疾病；无内分泌系统疾病；最近3月未应用任何甾体类药物。随访并根据膀胱镜检查及尿动力学检查结果分为fBOO组（39例），nBOO组（29例）。同期因其他泌尿生殖系统疾病接受手术或膀胱镜检查的育龄期妇女作为对照组（14例），其原发病分别为输尿管结石4例，腺性膀胱炎3例，膀胱阴道瘘2例，膀胱息肉2例，余为正常育龄妇女。 我们对绝经后妇女在术前24小时，育龄期妇女在月经周期第2天晨6：00—9：00空腹采静脉血5ml，取血清，用放射免疫法（RIA）分别测定3组妇女性激素水平，包括E2、T、P、FSH和LH。 每例受试者在膀胱镜检查或手术中分别取膀胱颈口（J区）及膀胱三角区（B区）5×5×5mm大小组织1块，用10％福尔马林固定24小时后进行浸蜡包埋，用免疫组化法（Envision三步法）分别测定3组妇女膀胱颈口及膀胱三角区部位的ER、PR、AR的表达。 所有数据用SPSS13.0 for windows软件包进行数据分析，计量结果以Mean±SD表示，组间比较采用卡方检验。 【结果】 1．一般临床资料： fBOO组与nBOO组的年龄、症状持续时间、月经初潮年龄和绝经年龄经统计学检验均无显著性差异（P＞0.05）。fBOO组，nBOO组和对照组的初潮年龄分别是14.2±2.1岁，13.7±2.4岁和16.2±2.1岁，前两者的初潮年龄均早与对照组，但仍无统计学差异（P＞0.05）。 2．血清性激素水平测定 fBOO组、nBOO组2组妇女血清E2值分别为19.8±14.2pg／ml，23.7±15.8pg／ml，2组间E2值的变化无特异性，经统计学检验无明显差异（P＞0.05）。但与对照组的血清E2值（78.2±51.7 pg／ml）比较，均有显著的降低，经统计学检验差异显著（P＜0.05）。 fBOO组、nBOO组和对照组3组妇女血清P值分别为0.3±0.24ng／ml，0.4±0.26ng／ml，0.4±0.24ng／ml，变化趋势一致，经统计学检验无明显差异（P＞0.05）。 fBOO组、nBOO组2组妇女血清T值分别为72.4±37.5ng／dl，43.6±28.4ng／dl，较对照组的23.4±19.3ng／dl有明显升高，有统计学差异（P＜0.05）。尤以前者升高的程度更为显著，组间比较经统计学检验有意义（P＜0.05）。 fBOO组、nBOO组2组妇女血清FSH值分别为71.2±33.1IU／L，89.4±21.9IU／L，2组间FSH值的变化无特异性，经统计学检验无明显差异（P＞0.05）。与对照组的血清FSH值（12.3±11.2IU／L）比较，有明显的升高，经统计学检验差异有显著性（P＜0.05）。 fBOO组、nBOO组2组妇女血清LH值分别为29.3±23.8IU／L，34.6±24.2IU／L，2组间LH值的变化无特异性，经统计学检验无明显差异（P＞0.05）。与对照组的血清LH值（5.4±3.8IU／L）比较，有明显的升高，经统计学检验差异有显著性（P＜0.05）。 3．膀胱壁不同组织ER、PR、AR的表达 对照组膀胱内各部位3种受体绝大多数均呈强阳性表达，且B区与J区间表达无明显差异（P＞0.05）。fBOO组、nBOO组2组的3种受体在B区及J区的阳性表达均明显低于对照组。nBOO组的ER、PR、AR在B区和J区的改变不明显，阳性表达分别为（12／17 vs 9／20，11／18 vs 9／20，9／20 vs 9／20），经统计学分析差异无显著性（P＞0.05）。fBOO组的ER、PR在B区和J区的阳性表达分别为（13／26 vs 12／27，12／27 vs 13／26），经统计学分析差异无显著性（P＞0.05），但AR在B区显著降低，阳性表达为3／36，明显低于同组J区的12／27，经统计学检验，P=0.018,有显著差异。与nBOO组B区比较，P=0.013，也有明显统计学意义。 【结论】 1、血清E2水平的降低及膀胱组织内ER的减少可能参与了膀胱出口梗阻的形成； 2、血清P水平及膀胱内PR的减少与膀胱出口梗阻关系不明显； 3、血清T水平的短暂升高、膀胱颈口组织内AR的相对增加及膀胱壁其他部位AR的明显缺失可能是女性膀胱出口梗阻发生的主要内分泌因素。 第二部分性激素对雌性大鼠膀胱壁结构的影响 【研究目的】 为了临床fBOO患者的激素替代治疗有合理的实验基础，我们进一步采用动物实验，了解雌、孕激素及雄激素对膀胱结构和功能的影响。 【材料与方法】 本实验选取四月龄雌性SD大鼠70只，体重180-200g，购于浙江大学医学院实验动物中心。随机分成7组：①假手术组（SHAM）、②单纯卵巢切除组（OVX）、③雌激素低剂量组（OVX+E）、④雌激素高剂量组（OVX+E1mg）、⑤孕激素组（OVX+P）、⑥雌激素和孕激素联合应用组（OVX+E+P）、⑦雄激素组（OVX+T）。除假手术组外其余均予以去势手术，手术后一周起开始注射药物。SHAM组和OVX组仅注射0.1ml茶油，其余5组分别给予苯甲酸雌二醇0.25mg／kg，苯甲酸雌二醇1mg／kg，黄体酮1mg／kg，苯甲酸雌二醇0.25mg／kg加黄体酮1mg／kg，丙酸睾酮3mg／kg。给药四周后，门静脉采血2ml，以放射免役法（RIA）测定血清E2、P、T值。比较各组SD大鼠处死前总重量及处死后膀胱及尿道的湿重。HE染色法光镜下测定各组大鼠的膀胱肌全层厚度，观察平滑肌形态，纤维组织增生情况等。透射电镜下观察各组逼尿肌的超微结构改变。 【结果】 1．血清E、P、T值水平 OVX组血清E2的浓度为11.43±2.59pg／ml，降低至SHAM组（70.74±11.10pg／ml）的15％左右，血清P值为9.68±3.06mol／l，与SHAM组25.56±8.08mol／l比较，下降了70％。补充低剂量E2（0.25mg／kg）后血清E2的浓度是170.48±63.32pg／ml，增加为SHAM组的2.5倍，给予高剂量E2（1mg／kg）后血清E2的浓度为504.10±203.25 pg／ml，增加至SHAM组的7倍。血清T值水平在OVX+T组升高明显，为13.38±8.59nmol／1，较SHAM组升高了26倍，其余各组T值甚低。 2．动物体重及下尿路组织重量测定 7组动物处死前体重分别为278.90±14.16g，279.40±15.42g，268.70±16.28g，272.30±12.19g，279.50±16.33g，276.00±14.63g，269.50±10.41g。各组间比较无显著性差异（P＞0.05）。OVX+E组与OVX+T组下尿路重量分别为162.19±17.45mg，160.34±14.43mg，均明显的高于SHAM组的133.48±15.78mg，经统计学检验有显著差异（P＜0.01）。OVX组、OVX+P组的下尿路重量分别为127.43±15.22mg，123.13±13.11，均明显小于SHAM组，有统计学意义（P＜0.01）。OVX+E1mg组与OVX+E+P组大鼠下尿路重量分别为150.93±20.81mg，153.32±22.27mg，较OVX+E组稍有减轻，但仍高于对照组（P＜0.05）。 3．膀胱壁光镜下观察 OVX组膀胱肌层明显萎缩变薄，肌细胞间隙增大，固有层内纤维结缔组织明显增多。SHAM组膀胱壁全层厚度为1.10±0.10mm，OVX组变薄为0.97±0.11mm，两者经统计学检验有差异（P＜0.05）。OVX+E组、OVX+E1mg组、OVX+T组膀胱肌层增厚明显，肌细胞肥大，排列紧密，肌细胞间纤维结缔组织减少，粘膜下层变薄。另外，补充小剂量雌激素后大鼠膀胱壁厚度较大剂量雌激素组增加更为明显。OVX+E+T组膀胱壁厚度与SHAM组无显著差异（P＞0.05）。OVX+P组膀胱壁厚度与OVX组相近，肌层较薄，肌间隙较宽，固有层内纤维结缔组织与单纯卵巢切除术后的大鼠膀胱壁改变相近，2组间比较无显著差异（P＞0.05）。 4．逼尿肌超微结构观察 卵巢切除后大鼠膀胱壁逼尿肌细胞分布不均匀，排列紊乱，大小不一，细胞间隙增大，连接松散，间质中可见大量排列紊乱的胶原纤维，缝隙连接减少；肌细胞萎缩，形态杂乱，可见胞膜成棘状，细胞肌丝排列不整齐，肌膜周围有高电子密度物质沉积，胞核固缩，线粒体部分变性，肌细胞核周围粗面内质网扩张，部分脱颗粒，部分肌细胞内出现较多溶酶体。雌激素、雄激素均可以使细胞间连接紧密，肌细胞排列趋向于整齐。但雌激素组胞浆内出现大量空泡，高剂量组尤为明显。雌激素和孕激素联合应用组肌间隙较宽大，细胞膜皱褶成波纹状。单纯补充孕激素对膀胱逼尿肌细胞的超微结构改变不明显，镜下改变与单纯卵巢切除术后改变类似，主要表现为肌细胞的萎缩和变性。 【结论】 雌激素和雄激素均可逆转卵巢切除导致的膀胱平滑肌萎缩，改善膀胱壁的结构。大剂量的雌激素可能对膀胱逼尿肌细胞有不良作用。孕激素必须在雌激素共同存在下才能发挥作用，且对雌激素有削弱效应。