Toll样受体2对小鼠过敏性炎症及PI3K/Akt自噬信号通路的调控研究

研究背景支气管哮喘是目前最常见的慢性气道炎症性疾病之一,发病率和病死率近50年来仍然保持持续增加,已经成为全球仅次于癌症的第二大致死和致残性疾病,其发病机制与体内免疫异常有关。Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)是一组能够识别病原微生物及细胞壁产物的跨膜蛋白质,在固有免疫和获得性免疫均有重要作用,在炎症免疫中发挥枢纽作用。TLR2是重要的TLRs之一,有研究报道哮喘的发病机制与TLR2有关。自噬是生物进化过程中真核细胞内发生的一种高度保守的细胞生物学现象,与多种免疫和炎症性疾病直接有关。近来研究发现,哮喘的病理变化中包含有细胞自噬的异常,然而,具体机制并不十分清楚。哮喘发病机制中有关自噬涉及的细胞通路以及其调控等问题研究较少。磷酯酰肌醇3激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)是细胞信号转导通路关键酶之一。PI3K还是常见的细胞自噬通路中关键的分子之一,有关PI3K介导的自噬通路在哮喘中的作用研究较少,其作用以及如何调控等尚待阐明。本研究中,我们采用OVA致敏并激发小鼠使之产生过敏性炎症,观察小鼠肺内炎症的变化以及TLR2在小鼠肺内的表达,同时使用TLR2基因敲除小鼠,对PI3K信号通路相关的炎症/自噬在过敏性炎症发病机制中的作用以及TLR2对该细胞通路的调控作用进行了较深入的探讨。研究目的:1、研究TLR2在小鼠过敏性炎症中的变化及其影响。2、研究TLR2对小鼠肺组织PI3K/Akt信号通路自噬活化水平的影响。研究方法1、过敏性炎症动物模型建立及肺内TLR2蛋白表达水平的检测OVA吸入致敏并激发野生型C57BL/6雌性小鼠,21天后留取小鼠肺泡灌洗液,瑞氏染色法观察炎症细胞总数及分类的变化,留取肺组织,采用H&E染色和PAS染色观察小鼠肺组织病理形态学变化;Western blot方法检测肺组织匀浆TLR2水平的表达。2、TLR2基因敲除对小鼠过敏性炎症及PI3K/Akt信号通路自噬活化水平影响OVA致敏并激发TLR2基因敲除小鼠和野生型小鼠,留取小鼠肺灌洗液,瑞氏染色法比较两组小鼠的炎症细胞总数和分类变化,ELISA法检测比较IL-13、IFN-γ水平的变化。留取肺组织,HE染色和PAS染色法观察比较两组小鼠肺组织病理学炎症变化;Western blot方法检测比较两组小鼠肺内My D88、PI3K、P-Akt以及Beclin-1和LC3-II自噬蛋白表达的变化。3、靶向抑制自噬对野生型和TLR2基因敲除小鼠气道过敏性炎症及自噬活化水平的影响给予小鼠OVA致敏和激发同时,予以自噬抑制剂3-MA处理。瑞氏染色法观察两组小鼠肺泡灌洗液内炎症细胞数量和分类的变化,ELISA方法检测肺灌洗液IL-13、IFN-γ水平;留取肺组织,HE染色和PAS染色法观察比较两组小鼠肺组织病理学炎症变化;Western blot方法检测比较两组小鼠肺内My D88、PI3K、P-AKT以及Beclin-1和LC3-II自噬蛋白表达的变化。研究结果1、OVA致敏并激发后小鼠肺内炎症以及TLR2蛋白表达水平的变化OVA致敏并激发后的野生型小鼠肺内出现明显的炎症性变化,肺组织切片HE染色可见支气管管壁明显增厚,平滑肌增生,支气管周围、血管周围及肺间质炎症细胞浸润明显增多;PAS染色可见小鼠支气管上皮杯状细胞增生明显,气管腔内粘液的分泌程度明显增多,部分呈粘液栓样。肺灌洗液中炎症细胞总数显著增高,中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞数量均明显增高;与对照组小鼠相比,小鼠肺组织匀浆中TLR2蛋白水平明显增高。2、TLR2基因敲除小鼠OVA致敏并激发后的肺内炎症减轻与野生型小鼠相比较,OVA致敏并激发的TLR2-/-小鼠肺泡灌洗液中的细胞总数、炎症细胞数以及IL-13水平的增高程度较低,IFN-γ水平的下降程度也较弱。肺内支气管管壁增厚、支气管周围、血管周围及肺间质的炎症细胞浸润程度较轻,支气管上皮杯状细胞增生及粘液分泌的增多程度较轻;与野生型小鼠比较,肺内炎症程度有明显的差异。3、TLR2基因敲除小鼠肺内PI3K/Akt自噬信号通路蛋白表达明显减弱OVA致敏并激发的野生型小鼠肺组织中My D88、PI3K、P-Akt、Beclin-1以及LC3-II蛋白的表达显著增高,与之比较,TLR2基因敲除小鼠肺内PI3K,P-Akt,Beclin-1和LC3-II蛋白的表达也有明显增高,但其增强程度明显弱于野生型小鼠,两组之间差异有统计学意义。4、3-MA抑制OVA诱发的野生型小鼠肺部炎症,而TLR2基因敲除小鼠肺部炎症没有明显改变OVA致敏并激发同时使用自噬抑制剂3-MA处理的野生型小鼠肺泡灌洗液中细胞总数和各炎症细胞数量的增高受到明显抑制,促炎因子IL-13水平的增高程度和抗炎因子IFN-γ水平降低程度有明显减小;肺组织病理组织学显示炎症程度有明显减轻。在OVA致敏并激发的TRL2基因敲除小鼠,同时使用3-MA处理时,肺内炎症未有明显降低。5、3-MA抑制OVA诱导的野生型小鼠PI3K/Akt自噬信号通路蛋白表达,而TLR2基因敲除小鼠蛋白表达无明显变化OVA致敏并激发的野生型小鼠,同时使用3-MA处理时,肺内增高的PI3K、P-Akt以及Beclin-1和LC3-II自噬蛋白的表达程度有明显降低。较高剂量的3-MA处理时上述变化更加显著;提示3-MA能抑制PI3K信号通路的自噬,其作用与其浓度相关。而在OVA致敏并激发的TLR2基因敲除小鼠,3-MA处理后PI3K、P-Akt以及Beclin-1和LC3-II自噬蛋白表达未有明显变化。研究结论:1、TLR2在小鼠过敏性炎症肺组织中明显增高,与过敏性炎症发生有关。2、TLR2可能通过PI3K/Akt信号通路对小鼠肺内自噬以及炎症起调控作用。