栀子苷抗LPS诱导的乳腺炎性损伤的分子机制

乳腺炎通常是由微生物感染乳腺所引发的炎性反应，是造成奶牛业损失的重大疾病。乳腺炎造成的损失中70%为产奶量下降，常归咎于乳腺组织损伤所引起的上皮细胞数量和活性的降低。栀子苷以其抗炎、抗氧化等药理作用被广泛应用，本研究利用原代奶牛乳腺上皮细胞、小鼠乳腺上皮细胞及小鼠乳腺炎动物模型，研究了栀子苷对LPS诱导的乳腺炎性损伤的保护作用，以期为栀子苷应用于临床治疗奶牛乳腺炎提供理论依据。 首先，利用组织块法和差速消化法，分离纯化原代奶牛乳腺上皮细胞，栀子苷预处理后给予LPS刺激，MTT法检测栀子苷对奶牛乳腺上皮细胞的毒性作用，qRT-PCR检测栀子苷对奶牛乳腺上皮细胞炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA水平的影响，LIVE/DEAD检测栀子苷对奶牛乳腺上皮细胞存活情况的影响。结果显示，栀子苷在0-200μg/ml浓度时对奶牛乳腺上皮细胞没有毒性作用；栀子苷能够显著降低由LPS刺激引发的奶牛乳腺上皮细胞TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA表达的升高；明显减少LPS诱导的细胞死亡。 其次，利用混合酶消化法，分离纯化原代小鼠乳腺上皮细胞，栀子苷预处理后给予LPS刺激，MTT法检测栀子苷对小鼠乳腺上皮细胞的毒性作用，ELISA检测栀子苷对乳腺上皮细胞炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响，LIVE/DEAD检测栀子苷对小鼠乳腺上皮细胞存活情况的影响，Western Blot检测栀子苷对NF-κB、MAPKs信号通路及Bax、Bcl-2、Caspase-3、p53和TLR4蛋白表达的影响。qRT-PCR检测栀子苷对TNF-α、IL-1β、IL-6等蛋白的mRNA水平的影响，结果显示，栀子苷在0-100μg/ml浓度时对小鼠乳腺上皮细胞没有毒性作用；栀子苷能够显著降低由LPS刺激引发的小鼠乳腺上皮细胞TNF-α、IL-1β和IL-6的表达升高；明显减少LPS诱导的细胞死亡，减少TLR4的表达，抑制NF-κB、MAPKs信号通路的激活，显著下调Bax的表达，促进Bcl-2的表达，抑制Caspase-3的裂解和p53的磷酸化。 最后，为进一步验证栀子苷抗LPS诱导的乳腺炎性损伤效果，实验利用乳导管灌注LPS建立小鼠乳腺炎模型，通过ELISA检测栀子苷对乳腺组织TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响，H.E.染色检测栀子苷对乳腺组织病理组织学变化的影响，TUNEL检测栀子苷对LPS诱导的乳腺组织凋亡的影响。结果显示，栀子苷能够显著减少乳腺组织炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平，保护乳腺结构的正常及完整性，减轻LPS诱导的小鼠乳腺组织的凋亡。 综上所述，本研究表明栀子苷通过减少TLR4的表达，抑制NF-κB、MAPKs信号通路的激活，显著下调Bax的表达，促进Bcl-2的表达，抑制Caspase-3的裂解活化和p53的磷酸化，从而发挥对LPS诱导的炎性损伤保护作用，且具有良好的效果。表明栀子苷是一个潜在治疗大肠杆菌性奶牛乳腺炎的药物，也许未来会应用于奶牛乳腺炎的治疗。