EGF相关因子和TGF-β1对人颗粒细胞排卵相关基因表达及相关信号通路的调控作用研究

第一部分研究背景排卵障碍是导致不孕症发生的一个重要因素。虽然很多动物实验已经证明表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)相关生长因子,特指双调蛋白(Amphiregulin,AREG)、β细胞素(Betacellulin,BTC)和表皮调节素(Epiregulin,EREG),通过调控环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)及其作用下的前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)的生成调节排卵的发生,但在人颗粒细胞未见相关研究。研究目的研究AREG、BTC和EREG在人颗粒细胞是否促进COX-2的表达及其作用下的PGE2的生成。研究方法采用SVOG细胞系研究AREG、BTC和EREG在人颗粒细胞排卵过程中的调节作用。SVOG细胞系是一株使用SV40T抗原转染人颗粒细胞得到的细胞系。分别采用RT-q PCR和western blotting进行m RNA和蛋白的检测。通过酶联免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测培养液中的PGE2水平。结果外源性给予LH促进AREG、BTC、EREG、COX-2和PGE2的表达上调;使用EGF受体(EGF Receptor,EGFR)小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)转染方法敲除EGFR阻断LH上调的COX-2表达及其作用下的PGE2的生成;AREG、BTC、EREG通过活化ERK1/2信号通路促进COX-2表达及其作用下的PGE2的生成,使用EGFR抑制剂或EGFR si RNA抑制EGFR活性或敲除内源性EGFR表达可以阻断这种上调作用。结论AREG,BTC和EREG通过活化ERK1/2信号通路促进人颗粒细胞COX-2的表达及其作用下的PGE2生成。第二部分研究背景COX-2及其作用下的PGE2是调控排卵发生的关键因素。转移生长因子-β(Transforming growth factor-beta,TGF-β)超家族不仅在卵巢组织分布广泛,而且在调控卵巢各种生理和病理过程中也具有重要作用。TGF-β1是TGF-β超家族的重要成员之一。虽然TGF-β1及其受体在人颗粒细胞上具有表达,而且颗粒细胞是调控排卵发生的重要部位,但截至目前,未见TGF-β1在人颗粒细胞是否促进COX-2表达及PGE2生成的相关报道。研究目的研究TGF-β1在人颗粒细胞是否促进COX-2的表达及其作用下的PGE2的生成。研究方法采用SVOG细胞系研究TGF-β1在人颗粒细胞排卵过程中的调节作用。SVOG细胞系是一株使用SV40T抗原转染人颗粒细胞得到的细胞系。分别采用RT-q PCR和western blotting进行m RNA和蛋白的检测。通过ELISA检测培养液中的PGE2水平。结果TGF-β1促进COX-2的表达和PGE2的生成。使用TβRI抑制剂或TβRI si RNA抑制TβRI活性或敲除内源性TβRI表达,可以阻断TGF-β1对COX-2表达和PGE2生成的促进作用。TGF-β1激活Smad2和Smad3信号通路,使用Smad2 si RNA或Smad3 si RNA抑制内源性Smad2和Smad3表达同样阻断TGF-β1对COX-2表达和PGE2生成的促进作用。结论TGF-β1激活Smad2/3信号通路促进人颗粒细胞COX-2的表达及其作用下的PGE2生成。第三部分研究背景卵巢颗粒细胞参与调控孕激素的生成,在卵巢类固醇甾体激素生成的过程中具有重要意义。类固醇激素合成急性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein,St AR)是孕激素合成过程的限速酶。很多因子参与St AR的表达,其中TGF-β1是非常重要的一个生长因子,在卵泡发育各个阶段均有表达,在人卵泡液中也可以检测到,并且颗粒细胞上TGF-β1及其受体均有表达,但TGF-研究目的β1在调节St AR及孕激素生成中的作用却未可知。研究目的研究TGF-β1在人颗粒细胞是否调控St AR的表达及孕激素的生成。研究方法研究方法采用SVOG细胞系研究TGF-β1在人颗粒细胞排卵过程中的调节作用。SVOG细胞系是一株使用SV40T抗原转染人颗粒细胞得到的细胞系。分别采用RT-q PCR和western blotting进行m RNA和蛋白的检测。通过ELISA检测培养液中的孕激素水平。结果TGF-β1下调St AR的表达及孕激素的生成。使用TβRI抑制剂或TβRI si RNA转染方法抑制TβRI活性或敲除内源性TβRI表达,可以阻断TGF-β1对St AR和孕激素生成的抑制作用。TGF-β1分别激活Smad2/3信号通路和ERK1/2信号通路,其中Smad3和ERK1/2信号通路参与TGF-β1下调的St AR表达及孕激素的生成。结论TGF-β1通过激活Smad3和ERK1/2信号通路抑制人颗粒细胞St AR的表达及孕激素的生成,参与人卵巢类固醇甾体激素生成的调节过程。