组蛋白去乙酰化酶抑制剂对烫伤休克大鼠肺微血管内皮细胞活化和通透性的影响

目的：1.观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI)对大鼠50%TBSAⅢ°烫伤休克模型肺微血管内皮细胞(PMEC)活化和通透性的影响；2.研究HDACI对体外TNF-α刺激PMEC活化和通透性的影响及其机制,为其用于致死性烫伤休克的早期救治提供实验依据。 方法：1.动物模型雄性SD大鼠,麻醉后随机分为①假烫组,水浴温度37℃15s；②烫伤组,水温80℃,背部和双下肢15 s、腹部8 s,造成50%TBSAⅢ°烫伤;③HDACI组,分别于烫伤后即刻皮下注射两种HDACI,丙戊酸钠(VPA)和2-甲基-2-戊烯酸(2M2P)(300mg／kg体重,100mg/m1)。各组大鼠分别于烫伤后2h、6h及12h,采用伊文斯蓝(EB)染色法检测肺血管通透性；腹主动脉取血检测HCT和脏器功能指标；取肺组织,干湿重法检测肺组织含水率,免疫组化法检测VEGF、E-selectin和ICAM-1表达；TUNEL法检测肺血管内皮细胞凋亡率。2.细胞培养雄性SD大鼠采用组织块法获得肺微血管内皮细胞(PMECs)。在24孔Transwell小室中建立单层PMEC细胞进行通透性试验,分为①对照组、②TNF-α组、③VPA组和④2M2P组。②③④组细胞加入TNF-α刺激(终浓度500ng/m1),③④组再分别加入VPA和2M2P(0.05mg/m1)。置于37℃,5%CO2培养箱6h后,在顶层小室中加入牛血清白蛋白(0.5mg/m1)。45min后在顶层小室和孔内各取样100μ1,BCA法检测蛋白浓度,计算通透系数。另在24孔板中每孔加入106细胞,分组及处理同上。孵育6h后取上清液,采用EL ISA法检测VEGF、sICAM-1. sE-selectin、和HSP70,裂解细胞提取核蛋白检测NF-κB浓度,流式细胞术检测细胞凋亡率。 结果：1.建立了50%TBSAⅢ°烫伤休克大鼠模型通过贴纸法确定50% TBSA烫伤面积,取烫伤部位组织病理检查确认达到Ⅲ°烫伤,烫伤组6h和12h死亡率分别为80%和100%。动物的临床表现、平均动脉压和脏器功能显示大鼠发生致死性烫伤休克。2. HDACI对烫伤休克大鼠模型肺血管通透性的影响与烫伤组相比,伤后2h和6h VPA组和2M2P组HCT和肺组织含水率降低,肺血管对EB的通透性降低(P均<0.05),肺水肿等病理改变减轻；VPA组作用显著强于2M2P组(P＜0.05)。3. HDACI对烫伤大鼠模型内皮细胞活化和凋亡的影响烫伤后2h和6h,烫伤组肺微血管内皮细胞VEGF、E-selectin、ICAM-1表达及凋亡率均较假烫组显著升高；VPA组2h和6h各细胞因子阳性表达率和凋亡率均显著低于烫伤组(p均<0.05)；2M2P组2h和6h各细胞因子阳性表达率与烫伤组无显著差异(P均>0.05),凋亡率显著低于烫伤组(p<0.05)。4.成功通过组织块法获得了稳定的大鼠PMEC,并对其进行了形态学和荧光免疫学鉴定。5. HDACI对TNF-α刺激PMEC单层细胞通透性的影响TNF-α刺激6h后,PMEC对牛血清白蛋白的通透系数Pa[×10-5ml/(min*cm2)]较对照组显著升高(435.10±36.87 Vs.72.54±11.38,p<0.05)。VPA组和2M2P组Pa显著低于TNF-α组,VPA的作用明显强于2M2P(276.55±30.18Vs.324.68±26.48,P＜0.05)。6. HDACI对TNF-α刺激PMEC释放细胞因子的影响TNF-α刺激后,VEGF、sE-selectin和sICAM-1表达均较对照组显著增加,VPA组上述因子水平显著低于TNF-α组(p均<0.05)；2M2P组与TNF-α组无显著差异(P＜0.05)。7. HDACI对TNF-a刺激PMEC后NF-κB p65表达的影响VPA能显著抑制TNF-α刺激引起的细胞核内NF-κB p65表达增加(872.31.55±133.48 Vs.1637.84.68±215.64 pg/ml,P＜0.05),而2M2P此作用不明显。8. HDACI对TNF-α刺激PMEC后HSP 70和凋亡率的影响与对照组相比,TNF-α刺激后PMEC表达HSP70增加(97.54±7.64Vs.25.14±4.38,P＜0.05),凋亡率升高(21.24±3.10% Vs.2.31±0.42%,P＜0.05)；VPA和2M2P能促进HSP70表达(177.88±19.85和126.35±14.89pg／m1),降低PMEC凋亡率(12.26±1.9%和16.42±2.6%),VPA作用明显强于2M2P(p<0.05)。 结论：大鼠50%TBSAⅢ°烫伤休克模型和体外PMEC细胞实验结果均表明,HDACI能显著抑制肺血管内皮细胞活化和凋亡,减少血管通透性增加引起的血容量丢失,VPA作用显著强于2M2P,其机制可能与HDACI抑制NF-κB途径及促进HSP70表达有关。本研究结果为HDACI用于致死性烧伤休克的早期救治提供了实验依据。