AIM2炎症复合体在牛分枝杆菌介导的IL-1β的分泌和细胞凋亡中的作用机制研究

牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)可以感染牛等多种动物和人类,造成结核病的发生,对养牛业以及人类健康造成极大的影响。与结核分枝杆菌类似,牛分枝杆菌进入机体肺脏中后主要被肺泡巨噬细胞吞噬,引起巨噬细胞的激活并产生一系列的促炎因子和趋化因子。IL-1β是机体抵抗分枝杆菌感染的重要的促炎因子之一,它可以调控免疫细胞的聚集和肉芽肿的形成,但是目前对于牛分枝杆菌调控IL-1p分泌的机制尚不清楚。本实验研究了牛分枝杆菌激活巨噬细胞与AIM2炎症复合体的关系,探讨了牛分枝杆菌在巨噬细胞中的定位,为深入研究机体对牛分枝杆菌在感染早期的固有免疫反应的机制提供了新的理论依据。 1.本研究首先用牛分枝杆菌以MOI10:1分别感染小鼠巨噬细胞J774a.1和小鼠骨髓源巨噬细胞BMDMs,检测细胞上清中caspase-1活性片段p10和IL-1p活性片段p17,证实了牛分枝杆菌可以引起caspase-1的活化和IL-1β的分泌。为了研究牛分枝杆菌与AIM2炎症复合体的关系,我们采用基因干扰的方法对AIM2炎症复合体的关键组成成分AIM2和ASC进行siRNA干扰,然后检测干扰前后牛分枝杆菌引起的caspase-1活化、IL-1β分泌和细胞死亡率的变化情况,以及干扰前后促炎因子TNF-a和CCL3mRNA水平的变化。结果表明,牛分枝杆菌引起的caspase-1的活化、IL-1p的分泌和细胞死亡均依赖于AIM2炎症复合体,并且AIM2炎症复合体的激活是促炎因子和趋化因子产生的重要条件。 2.我们研究了细胞内钾离子外渗、细胞内活性氧族ROS、细胞吞噬作用三种途径与牛分枝杆菌诱导的小鼠巨噬细胞AIM2炎症复合体激活的关系,分别采用细胞外液高浓度钾离子、ROS抑制剂NAC、细胞吞噬抑制剂细胞松弛素D与牛分枝杆菌共同作用于小鼠J774a.1细胞,检测细胞上清中成熟IL-1β的分泌情况以及细胞中AIM2和ASC mRNA水平的表达变化；研究结果表明细胞外高浓度的钾离子和细胞松弛素D可以通过不同的途径显著抑制牛分枝杆菌引起的IL-1β的分泌以及AIM2和USC mRNA表达水平的上调。然后我们又研究了AIM2炎症复合体与干扰素之间的关系,检测AIM2干扰后I型干扰素IFN-β mRNA水平的变化以及外源性IFN-β和IFN-β处理后牛分枝杆菌引起的caspase-1活化和IL-1p分泌的变化情况；结果表明干扰AIM2可显著性促进IFN-β mRNA水平的上调,外源性的IFN-β可以通过抑制IL-1p前体的转录来影响IL-1p的分泌,但不影响caspase-1的活化,而]IFN-γ不影响IL-1β的分泌。最后,我们使用透射电子显微镜技术观察了牛分枝杆菌在细胞中的定位,发现在感染后24h牛分枝杆菌可以从吞噬小体中进入细胞质中。 3.为了研究AIM2炎症复合体与细胞凋亡之间的关系,我们使用基因干扰技术沉默巨噬细胞中的AIM2基因,检测干扰前后牛分枝杆菌感染引起的caspase-3、caspase-8和caspase-9的活性变化以及线粒体膜电位的变化；结果表明干扰AIM2可以抑制细胞凋亡的发生和线粒体膜电位的改变。