垂体促肾上腺皮质激素细胞的糖皮质激素快速反馈机制研究

下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）是生命体内分泌系统的重要组成部分，参与控制应激反应，并调节消化、免疫系统、心情和情绪、性行为以及能量贮存和消耗等活动，具有重要的生理作用。而HPA中糖皮质激素反馈可快速抑制垂体促肾上腺皮质激素细胞中促肾上腺皮质激素（ACTH）的分泌和ACTH前体-亲阿黑皮素原（POMC）hnRNA的转录，整个过程需要糖皮质激素、相关受体、蛋白激酶及其他细胞因子的参与，并有报道称ACTH的快速抑制存在非基因组水平的调控过程，作用机制十分复杂。 为阐明ACTH分泌快速抑制的非基因组反应机理，本研究一方面将大鼠垂体细胞与微载体珠子共培养，采用细胞灌注系统，模拟正常状态下垂体细胞所处的动态生理环境，探求促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）和皮质酮对垂体细胞ACTH分泌的作用及其调控机制。另一方面在表达内源性糖皮质激素受体（GR）的下丘脑细胞系4B以及几乎无内源性GR表达的COS7细胞中转染了EGFP-GR及突变型载体，研究保守序列中氨基酸对GR与细胞膜配体结合、转运和配体结合功能的相对重要性。 细胞灌注系统结果表明，垂体细胞中ACTH的分泌水平可随CRH浓度增加而升高，30pM的CRH持续刺激可诱导垂体细胞在近似于正常生理环境的下稳定分泌ACTH。糖皮质激素反馈的灵敏度取决于糖皮质激素刺激的浓度与刺激前溶液中糖皮质激素的含量。延长无血清培养液孵育时间降低糖皮质激素，生理水平的皮质酮能快速抑制CRH刺激引起的ACTH分泌，并且在终止皮质酮刺激后快速恢复。重复地进行皮质酮刺激可引起ACTH的脉冲式分泌。这些结果表明垂体促肾上腺皮质激素细胞的糖皮质激素快速反馈是超日节律脉冲生成的重要组成部分，并且对慢性刺激和因基础生理循环高水平的糖皮质激素引起的紊乱中的HPA轴的调节有重要意义。 同时，本研究发现皮质酮对ACTH分泌的抑制属非基因组反应水平，不受转录抑制剂或蛋白合成抑制剂的影响。皮质酮对CRH引起的蛋白激酶Src磷酸化开始有抑制作用，而后转变为促进作用。蛋白激酶Src抑制剂对皮质酮抑制的ACTH分泌无显著影响，但单独使用抑制剂时显著抑制CRH刺激引起的ACTH分泌，说明皮质酮引起的早期CRH刺激的Src磷酸化抑制可能参与了糖皮质激素的快速反馈。 本研究还发现，细胞膜存在GR的表达，生理水平的皮质酮（10nM）能诱导GR向细胞膜的转运和解离，而GR拮抗剂阻断糖皮质激素对ACTH分泌的抑制,表明GR可介导糖皮质激素的快速反馈。然而，与类固醇激素受体家族成员细胞膜配体结合机制不同，大鼠GR蛋白683位点的半胱氨酸棕榈酸化并不影响GR与细胞膜的配体结合。经放射性标记的棕榈酸孵育的GR免疫共沉淀蛋白和放射自显影都未能检测到GR的放射活性，表明棕榈酸化并不直接影响GR与细胞膜的配体结合能力。而处于GR配体结合区域内第八个螺旋区的L687-690A，L682A，E680G和K685G突变载体抑制了细胞核和细胞膜的定位以及与[3H]-地塞米松的结合。突变载体L687-690A能减少GR与热休克蛋白90的结合，并抑制受体的转录活性，表明位于糖皮质激素受体保守序列中第八个螺旋区内的氨基酸位点678-689对于配体的结合和受体的功能至关重要，而该区域则是影响GR生物活性的重要区域。