颈椎病(cervical spondylosis,CS)是全球范围内常见的公共健康问题,在职业性多发病和致残因素中占很大比例,给个人、家庭、社会、医疗系统带来严重的影响和经济负担。颈椎病的发病率逐年上升,呈现出普遍化、年轻化趋势。颈椎病临床表现复杂多样,可表现为疼痛、神经根和脊髓等受压引起的一系列症状和体征,常见颈肩背疼痛、头痛头晕、颈部板硬、上肢麻木、上肢肌力减弱和感觉减退缺失等。颈椎病的防治工作已引起各界广泛关注,对颈椎病的研究有重要的现实意义。针刀疗法作为一种中医新疗法自上世纪70年代末发明至今在临床上推广较快,针刀疗法已成为治疗颈椎病常用方法之一,颈椎病是针刀疗法的优势病种和适应症。针刀治疗颈椎病临床疗效肯定,但针刀疗法基础研究薄弱,针刀治疗颈椎病疗效机制的研究亟待开展。
研究目的
本研究通过模拟人类颈椎病好发因素长期低头位造成颈椎病兔模型,HE染色光镜观察颈后伸肌和颈椎间盘改变以及造模前、造模后、干预后3个时间节点拍颈椎X线片,探讨颈肌劳损在颈椎病发病中的作用。造模后针刀干预颈椎病兔模型并与电针对照,观察针刀干预对颈后伸肌TUNEL阳性细胞核计数和凋亡因子Bcl-2.Bax.Caspase-3的基因和蛋白表达水平,以期从影响颈后伸肌细胞凋亡的角度探揭示针刀治疗颈椎病可能的作用机制,为临床针刀治疗颈椎病和经筋病提供实验依据。
研究方法
选用6月龄健康成年新西兰兔(雌雄各半)随机分为空白组、模型组、针刀组、电针组,采用长期低头位方法制备颈椎病模型。造模后针刀组、电针组进行治疗干预,针刀组每周干预1次,电针组每周干预3次,针刀电针干预均为三周。各组动物于造模前、造模后、干预后3个时间节点拍颈椎X线片；HE染色光镜观察颈后伸肌、颈椎间盘的病理学表现；TUNEL法检测颈后伸肌TUNEL阳性细胞核数；Real-time PCR法检测Bcl-2 mRNA.Bax mRNA.Caspase-3 mRNA的表达水平,Western blot(?)去检测Bcl-2.Bax. Caspase-3蛋白的表达水平
研究结果
1.颈后伸肌组织和颈椎间盘HE染色光镜观察结果显示,模型组肌纤维着色不均,肌纤维变性,细胞核增多,纵横面均见核内移,结缔组织增生及瘢痕形成,见炎性细胞浸润,肌纤维呈波浪状、节段状扭曲改变,肌纤维溶解变性,肌纤维水肿,间质增生；针刀干预后颈肌组织肌纤维较完整,肌纤维较平直未见明显扭曲,针刀干预可有效促进颈肌组织的修复。模型组颈椎间盘髓核几乎全部纤维化,髓核组织中胶原纤维增生、满布软骨样细胞,大多数软骨样细胞的排列与胶原纤维的走行方向相一致；针刀和电针干预后椎间盘髓核纤维化程度较模型组稍轻,伸向髓核的增生纤维组织较模型组疏松。
2.颈椎X线片显示造模后颈椎曲度改变,出现反张,椎间隙变窄,部分见椎间孔变小、椎体前后缘见骨质增生；针刀干预后见颈椎曲度改善较明显,曲度由反张变为较直,部分见椎间孔较治疗前变大、椎间隙有所改善,治疗前后骨质增生未见明显变化；电针干预后见部分兔颈椎反张有改善,治疗前后椎间隙、椎间孔、骨质增生未见明显变化。造模后,模型组、针刀组、电针组颈椎X线积分均明显升高,与空白组相比均有显著差异(P<0.01)；针刀干预后X线积分改善程度与模型组比较有显著差异(P<0.01)；电针干预后X线积分改善程度与模型组比较无统计差异(P>0.05)；针刀组干预后X线积分改善程度较电针明显(p<0.05)。
3.TUNEL实验结果显示模型组颈后伸肌TUNEL阳性细胞核计数较空白组明显升高异(P<0.01)；针刀组较空白组略微升高,但二者无统计差异(P>0.05)；针刀组较模型组明显降低(P<0.01)；电针组较空白组明显升高(P<0.01)；电针组较模型组有所降低,但二者无统计差异(P>0.05)；针刀组较电针组明显降低(p<0.01)。
4.Real-time PCR实验结果显示各组Bcl-2 mRNA表达水平无统计学差异(P>0.05)；模型组Bax mRNA.Caspase一3 mRNA表达水平较空白组明显升高(P<0.01,P<0.05),Bcl.2/Bax mRNA比值较空白组明显降低(P<0.01)；针刀组Bax mRNA.Caspase-3 mRNA表达水平较模型组明显降低(P<0.01,P<0.05),Bcl-2/Bax mRNA比值较模型组明显升高(P<0.01)；电针组Bax mRNA.Caspase-3 mRNA表达水平与模型组比较无统计差异(P>0.05),Bcl-2/Bax mRNA比值较模型组升高但二者无统计差异(P>0.05)。表明针刀干预可有效下调促凋亡因子Bax mRNA.Caspase-3 mRNA的表达水平和上调Bcl-2/Bax mRNA比值,针刀组效果优于电针组。
5.Western blot实验结果显示各组Bcl-2蛋白表达水平无统计差异(P>0.05)；模型组Bax.Caspase-3蛋白表达水平较空白组明显升高(P<0.01,P<0.05),Bcl-2/Bax蛋白比值较空白组降低(P<0.05)；针刀组Bax.Caspase-3蛋白表达水平较模型组降低(P<0.05),Bcl-2/Bax蛋白比值较模型组升高(p<0.05)：电针组Bax.Caspase-3蛋白表达水平与模型组比较无统计差异(p>0.05),Bcl.2/Bax蛋白比值较模型组升高但二者无统计差异(P>0.05)。Western blot实验结果与Real-time PCR实验结果基本一致,表明针刀干预可有效降低促凋亡因子Bax.Caspase-3蛋白表达水平和上调Bcl-2/Bax蛋白比值，针刀组效果优于电针组。
6.颈后伸肌TUNEL阳性细胞核计数与其他指标相关性分析结果：颈后伸肌TUNEL阳性细胞核计数与干预后颈推X线积分（r=0.832, P<0.01)、Bax mRNA ( r=0.669,P< 0.01)、Caspase-3 mRNA ( r=0.644,P< 0.01)、Bax蛋白（r=0.522,P< 0.01)、Caspase-3蛋白（r=0.667, P< 0.01 )均呈显著正相关；颈后伸肌TUNEL阳性细胞核计数与Bcl-2/Bax mRNA比值(r=-0.613 ,P< 0.01 )> Bcl-2/Bax蛋白比值（r=-0.700,P< 0.01 )均呈显著负相关；颈后伸肌TUNEL阳性细胞核计数与Bcl-2 mRNA表达水平（r=-0.145, P > 0.05 )、Bd-2蛋白表达水平（r=-0.247, P> 0.05 )均无明显相关性。
研究结论
1. 针刀干预对颈椎病兔颈后伸肌细胞凋亡有良好的调节作用，可以降低颈后伸肌TUNEL阳性细胞核数。
2. 针刀干预可以下调颈推病兔颈后伸肌Bax、Caspase-3基因和蛋白表达水平，上调Bcl-2/Bax mRNA和蛋白比值。
3. 针刀干预对骨骼肌细胞凋亡的调节作用可能是其治疗颈推病和经筋病的重要机制之一。
