玉米中伏马菌素免疫学快速筛检方法研究

伏马菌素(Fumonisins)主要是由串珠镰刀菌、多育镰刀菌等产生的一类真菌毒素,至今已经发现的伏马菌素及其衍生物已达20余种,其中最为主要的是B族伏马菌素中的伏马菌素B1(FB1)、伏马菌素B2(FB2)和伏马菌素B3(FB3)。FB1主要污染的食品(或饲料)是玉米及其制品,且广泛发生于世界各地。伏马菌素属于2B类致癌物质,很多动物实验已经证明其具有致癌性,有调查显示伏马菌素与人类的食管癌具有相关性。由于伏马菌素对人和动物健康的严重危害性,其在食品卫生领域中越来越受到人们的重视。目前,伏马菌素的检测方法主要有液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、免疫学检测法等。由于仪器分析方法样品处理相对复杂、成本高,限制了应用的推广。而免疫学方法具有灵敏度高、特异性好、样品处理简单、成本较低等优点,尤其适合大量样品的快速筛检。本实验在制备伏马菌素完全抗原及单克隆抗体的基础上,建立了玉米样品中伏马菌素的间接竞争ELISA(ic-ELISA)、胶体金免疫层析(GICA)和间接竞争化学发光酶免疫测定(ic-CLEIA)快速免疫学筛检方法,以期为进一步研究伏马菌素快速检测试剂产品奠定基础,满足实际检测的需求。 本文采用戊二醛法将小分子半抗原FB1分别与卵清蛋白(OVA)、牛血清蛋白(BSA)偶联制备检测抗原和免疫抗原,SDS-PAGE电泳及紫外扫描法鉴定偶联成功。常规免疫和快速免疫两种方式免疫BALB/c鼠,常规方法融合并筛选杂交瘤细胞。获得3株稳定分泌伏马菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并优选了其中的4B3细胞株,小鼠腹水诱生法制备单克隆抗体。该单克隆抗体为IgG1亚类,辛酸-硫酸铵法纯化后单克隆抗体浓度为2.19 mg/mL,纯度为85.95%。抗体亲和常数为5.21×109 L/mol、效价为1:2.56×106。4B3抗体与FB2、FB3的交叉反应率分别为198%和59%;与脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、T2毒素、桔青霉素、赭曲霉素A、黄曲霉素B1的交叉反应率均小于10%。 利用该单克隆抗体建立了伏马菌素间接竞争ELISA检测方法,优化后的检测条件为:抗原包被浓度为0.5μg/mL,包被条件为37℃2 h;抗体工作浓度为1:30 000; 37℃竞争反应45 min;酶标二抗工作浓度1:5 000,作用时间37℃60 min;底物作用时间37℃避光25 min;间接竞争ELISA方法的线性回归方程为:y = -41.499x + 89.715,相关系数(R2)为0.981,线性范围为1.56 ng/mL～50 ng/mL,最低检出限为1.30 ng/mL;玉米加标回收实验结果表明,该方法总的平均回收率为(94.73±4.54)%、批内变异系数为8.31%、批间变异系数为8.54%;对14个玉米实际样品进行了检测,5个样品未检出FB1、6个样品中FB1的含量小于1 mg/kg、3个样品中FB1的含量在1 mg/kg～2 mg/kg之间。 柠檬酸三钠还原法制备20 nm的胶体金溶液,与伏马菌素单克隆抗体合成金标探针,组装了简易胶体金免疫层析试纸条,优化了试纸条各项参数,试纸条裸眼可视检出限为2.5 ng/mL、最佳判定浓度为30 ng/mL,试纸条稳定性可达6个月以上。加标样品测定结果显示,甲醇:水(70:30,v/v)提取的玉米样品,可直接稀释5倍后上样检测,检测结果与标准品曲线相符。14个玉米样品测定结果显示,3个样品中伏马菌素浓度不低于0.75 mg/kg;10个样品中伏马菌素含量小于0.25 mg/kg;1个样品中伏马菌素浓度在0.25 mg/kg～0.75 mg/kg之间。 利用该单克隆抗体建立了伏马菌素间接竞争化学发光酶免疫检测法,优化后的检测条件为:包被抗原25 ng/mL,4℃过夜;抗体使用浓度为1:100 000,37℃45 min;酶标二抗工作浓度1:10 000,37℃60 min;现配化学发光底物溶液,室温避光10 min。标准曲线方程为:logit (y) = 1.079 5 - 2.299 8 log (x),相关系数(r)为-0.998 2,线性范围为0.32 ng/mL～25 ng/mL,最低检出限为0.32 ng/mL。玉米加标回收实验表明,该方法总的平均回收率为(100.15±9.55)%、批内变异系数为7.90%、批间变异系数为8.12%。对14个玉米实际样品进行了检测,其中5个样品未检出FB1、6个样品中FB1的含量小于1 mg/kg、3个样品中FB1的含量在1 mg/kg～2 mg/kg之间。 利用LC-MS/MS检测方法,乙腈/水提取、伏马菌素TC-F120专用净化柱净化处理样品,对玉米样品中的伏马菌素进行了测定并与前述建立的免疫学方法进行了比较分析。LC-MS/MS方法验证结果表明,免疫学检测方法分析结果与LC-MS/MS分析结果相符。所建立的胶体金免疫层析法、间接竞争ELISA检测方法和化学发光酶免疫检测法可以用于玉米样品中伏马菌素的快速筛检。