应激及其药物干预的代谢组学研究

应激是指当机体遭遇包括创伤、中毒、环境温度剧烈变化、饥饿疲劳以及情绪紧张、恐惧、激动等各种强烈的刺激时,促肾上腺皮质激素、糖皮质激素的分泌即刻大幅度增加,引起机体的各种适应性、抵抗性变化的一种机能状态。急性应激反应是自我限制的过程,一旦应激原的作用终止后,体内的自稳态得到恢复,应激反应的过程也就停止。但是如果应激原的作用过度强烈,导致促皮质素释放激素和去甲肾上腺素大量分泌,就会影响生物体的多种生理机能。长期强烈身心应激严重影响着的身心健康,使机体出现抑郁症、学习和记忆障碍、应激性精神紊乱、痴呆、正常衰老过程加速、免疫力低下等等多系统疾患。目前研究应激的绝大部分研究工作是围绕生物体的组织和血液进行的,而这些生物样本的采集本身对于机体也构成了另一种应激,进而可能对结果产生干扰和误导;因为机体的应激反应是一个动态的过程,这样的研究缺乏对于动物整体状态变化的连续监测;应激也是一个系统反应,涉及到生物体的各个生理过程,影响众多代谢通路,仅依靠几个指标远不能反映其全貌。对于长期应激所产生的亚健康状态,以及药物的抗应激作用,在医学上始终没有找到合适的客观评价标准。基于上述问题,我们希望采用一种无刺激、连续动态的系统的研究方法来评价机体的应激状态,探索其机制,从而建立客观的评价标准,为临床和实验室中应激及相关疾病的判定提供依据。 代谢组学又称代谢物组学,是研究机体代谢产物谱变化的一种新的系统方法。作为一种“组学”科学,它借助高通量、高灵敏度与高精确度的现代分析技术,分析细胞、组织和其它生物样本如血液或尿液中内源性代谢物整体组成并通过其复杂的、动态的变化来辩识和解析被研究对象的生理病理状态。代谢物组是蛋白质组、转录组和基因组总体表达的结果,直接反映组织的生化状态,能够较灵敏地刻画生命体生理病理状态的变化,对于阐明生命复杂系统具有极为重要的意义。其最主要的特征就是高通量的实验和大规模的计算,从系统生物学的角度出发,全面地综合地考察机体代谢的变化。 因此本论文建立了代谢组学方法评价和研究急慢性应激和相关疾病以及不同药物干预的效果,主要内容如下: 1.建立急性冷应激的代谢组学评价方法,采用氯甲酸乙酯衍生化GC/MS的分析方法测定冷应激前后大鼠的尿样,得到尿中小分子代谢物的指纹图谱,结合模式识别（PCA和PLS-DA）等多维统计分析方法计算,峰响应信号的主成分分析图上显示冷应激前后正常大鼠尿液内源性代谢物产生明显分离,人参组则几乎无分离。采用多维与单维统计结合的方法,找到与正常大鼠冷应激前后分组相关的物质,发现其中与应激相关的部分代谢物如酪氨酸、色氨酸等物质的相对含量产生显著变化,从这些变化可推测机体系统对冷应激的应答以及应激后自我调节的过程,而这些物质中绝大多数在人参皂苷组中变化的显著性降低或者已无显著性。从代谢物的角度证实冷应激对机体作用、机体的自我恢复以及人参皂苷的抗应激作用。 2.建立快速、高效的固相萃取-超高效液相色谱质谱联用的方法同时定量测定大鼠尿液中的17种人参皂苷含量。选择萃取回收率和重复性高的HLB固相萃取柱,同时优化液相色谱及质谱的仪器条件,方法的专属性、线性范围、回收率、日内日间精密度和稳定性均符合生物样本的测定要求。采用该方法测定了正常状态下和冷应激过后大鼠尿样中皂苷类代谢物,结合多、单维数据分析后发现冷应激可显著改变Rc、Rb1等人参皂苷类物质在尿液中的含量。 3.采用慢性应激和孤养两种经典模型相结合的制模方法制作慢性轻度不可预见性的应激抑郁模型,在27天的应激过程中测定了敞箱实验行为学得分,24h摄食总量,体重,游泳不动时间,糖水消耗量,肾上腺、胸腺和脾重量以及肾上腺、胸腺以及脾指数,血浆促皮质激素（ACTH）和血清皮质酮水平。以上指标反应了随着应激时间的延长,模型组大鼠逐渐呈现出类似于人类抑郁症的症状。同时进行的药物干预中,人参皂苷组各项指标均显著优于模型组,氯米帕明和贯叶连翘提取物组总体优于模型组,对动物的抑郁状态表现出不同程度的干预作用。 4.建立慢性应激的代谢组学评价方法,采用气相-质谱联用结合多维统计数学处理方法考察了慢性应激过程中大鼠尿液样本。内源性代谢物峰响应信号的主成分分析图上显示慢性应激组9,27天大鼠尿样可与0天该组以同天对照组显著分离。采用多维与单维统计结合的方法,分别找到与分组相关的物质的交集。在差异表达的代谢物的交集中,第9天的结果与急性应激的差异物质部分一致,显示了应激反应的特异性。第27天的结果与应激和抑郁症均有关系,这些物质中绝大多数在给药+应激组中变化的显著性降低或者无显著性,因此可从代谢物的角度证实了这三种抗抑郁药物的作用。 5.采用气相-质谱联用结合多维统计数学处理方法考察了慢性应激后各组大鼠的脑组织提取液。内源性代谢物峰响应信号的主成分分析图上显示慢性应激组与对照组显著分离,给药组呈现不同程度的回归趋势。采用多维与单维统计结合的方法,分别找到与慢性应激和正常大鼠分组相关的小分子内源性代谢物,发现脑组织中与应激以及抑郁相关代谢物的含量发生显著变化,这些物质中多数在给药组中变化的显著性降低或者无显著性。三种抗抑郁剂中,人参皂苷改善的代谢物最多也最为明显,贯叶连翘提取物次之,氯米帕明最少。从代谢组学的角度研究了慢性应激导致的脑组织代谢物谱的变化,同时证实了抗抑郁药物的作用。