薯蓣皂甙元酶联免疫吸附（ELISA）定量分析方法的初步研究

薯蓣皂甙元是合成多种甾体激素类药物和甾体口服避孕药比较理想的前体,世界各国生产的甾体激素60%以上以它为原料。常用的薯蓣皂甙元定量分析方法有电化法、比色法、薄层扫描法、旋光法、高效液相色谱法等,与这些方法相比,ELISA方法具有灵敏度高,样品消耗量少,提取纯化步骤少,操作简单等优点。本课题研究薯蓣皂甙元ELISA定量分析方法的建立。 由于薯蓣皂甙元分子量低,本身不具有抗原性,也不具有能直接与大分子偶联的活性基团。建立薯蓣皂甙元的ELISA定量分析方法必须先将其衍生化引入一个活性基团,再与大分子偶联,从而合成薯蓣皂甙元的全抗原。 本论文利用薯蓣皂甙元3位上的羟基,以DMAP作催化剂,使薯蓣皂甙元与丁二酸酐反应,以TLC检测反应终点,合成了薯蓣皂甙元丁二酸单酯,成功地在薯蓣皂甙元3位上引入一个带有羧基的基团。对反应条件进行了优化,确定最佳反应条件为:薯蓣皂甙元与丁二酸酐物质的量之比为1:4,催化剂DMAP与丁二酸酐质量之比为0.08:1,反应温度为90℃。用MS、IR、1H-NMR、13C-NMR等方法对产物结构进行了表征。 采用混合酸酐法和脂溶性碳二亚胺法（DCC）制备了薯蓣皂甙元与牛血清白蛋白的结合物（DG-HS-BSA）,经TNBS测定,每分子结合物连接的薯蓣皂甙元分子数分别为28.2和1.5。采用水溶性碳二亚胺法（EDC）和脂溶性碳二亚胺法制备了薯蓣皂甙元与卵清蛋白的结合物（DG-HS-OVA）,经TNBS测定,每分子结合物连接的薯蓣皂甙元分子数分别为7.1和0.8。研究表明,混合酸酐法与水溶性碳二亚胺法的偶联效果明显优于脂溶性碳二亚胺法。 以混合酸酐法制得的DG-HS-BSA作为免疫原去免疫三只新西兰雄兔,每次每只剂量为0.8mg,皮内注射。以EDC法制得的DG-HS-OVA作为包被原,用免疫印迹法定性检测所得血清。结果表明,三只兔子都产生了抗薯蓣皂甙元的抗体。 对薯蓣皂甙元ELISA测定的一些重要的影响因素进行了研究。在用明胶封闭的条件下,二抗、血清与酶标板的非特异性吸附反而比不封闭增强。当血清稀释度为1/3125以上时,OD（阴性）-OD（空白）接近于0,血清与板的非特异