利用新型组织工程软骨修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的：评估实验室自主研发的壳聚糖水凝胶结合肋软骨细胞构建的新型组织工程软骨对兔关节软骨缺损的修复效果。 方法：（1）取24周龄新西兰大白兔肋软骨，酶消化后体外扩增培养得到软骨细胞。（2）软骨细胞传代扩增后，观察细胞形态，并绘制细胞生长曲线。P2代细胞爬片生长后，通过番红-O染色（Safranin-O）、甲苯胺蓝染色（Toluidine blue, T&B）、蛋白聚糖免疫荧光染色（Aggrecan）、II型胶原（Collagen II）免疫组织化学染色鉴定软骨细胞。Collagen II免疫组织化学染色观察P1-P4代软骨细胞的胞外基质分泌情况。（3）将P2代软骨细胞种植于实验室自制的新型壳聚糖水凝胶中构建组织工程软骨，并置于20％FBS的DMEM完全培养液中培养1周后，冰冻切片，苏木素-伊红(Hematoxylin-eosinstaining, HE)染色， T&B染色及Collagen II免疫组化染色观察细胞在支架上的生长情况。（4）制作兔膝关节软骨缺损模型并分为3组，实验组植入初步构建的组织工程软骨，对照组植入单纯的壳聚糖水凝胶，空白组不做任何处理。术后分别于4，8，12周取材，通过大体观察、HE染色、Safranin-O及CollagenII免疫组化染色等方法观察缺损关节软骨的修复情况，并用国际关节软骨修复协会ICRS制定的评分法进行大体及组织学评分。 结果：（1）体外培养获得了大量纯度较高的肋软骨细胞，显微形态学及免疫组织化学染色结果表明体外培养的P1-P3肋软骨细胞可保持稳定的表型，而P3代以后肋软骨细胞增殖缓慢，并出现衰老分化。（2）HE染色结果表明，软骨细胞散在地分布于似软骨陷窝的材料孔隙中，细胞的T&B染色及Collagen II免疫组化染色结果为阳性，表明肋软骨细胞在水凝胶支架上增殖情况良好。（3）术后4周，实验组缺损软骨即可见明显修复；术后8周，实验组关节软骨缺损处得到进一步的修复，组织化学染色结果表明新生组织中有透明样软骨生成。术后12周，大体观察可见实验组关节软骨缺损处修复完全，组织化学染色结果表明新生组织与正常软骨组织边缘模糊，与软骨下骨连接紧密，新生组织内软骨陷窝排列有序,与正常软骨陷窝相似，修复组织以透明软骨细胞为主。相较而言，对照组的缺损的关节软骨也得到了部分修复。而空白组缺损软骨的自我修复情况较差，术后12周，缺损仍旧明显，且染色结果显示缺损处的新生组织多为纤维软骨。ICRS大体及组织学评分结果显示实验组的修复情况与其他两组有显著性差异（P<0.05）。 结论：（1）采用胰蛋白酶及II型胶原酶消化培养的方法，可从肋软骨中获得大量纯度较高的原代软骨细胞。（2）体外培养的P1-P3代肋软骨细胞可维持正常软骨细胞的形态学特征及生物学功能，可用于构建组织工程软骨。（3）种植于新型壳聚糖水凝胶支架中的软骨细胞可粘附，增殖，分泌细胞外基质。（4）实验所构建的新型组织工程软骨对缺损关节软骨具有良好的修复作用，且修复是一种完全的结构性的修复。