干旱胁迫黄芩生理生态变化及其黄芩苷生物合成的分子生态机制

黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）为唇形科黄芩属药用植物,根入药。主要分布于我国东北、华北、西北等地。但不同产地黄芩由于生态环境不同导致药材质量差异很大,严重影响了黄芩药材原料及其产品质量的稳定性。本课题组前期研究发现,水分是影响黄芩药材质量形成的主要限制性生态因子,适度干旱胁迫可促进黄芩药效成分积累。因此,本研究在此基础上,从植物生理与分子生态学的角度,系统开展黄芩苷对干旱胁迫响应规律研究,探讨黄芩药材质量形成的分子生态机制,对提升黄芩精细化栽培技术、实现药材质量调控具有重要的理论意义和应用价值。本研究首先探索长期干旱胁迫对黄芩苷的影响,并在此基础上,分别对黄芩苷积累的关键时期进行短期干旱胁迫和短期干旱胁迫及复水研究,寻找干旱胁迫对黄芩苷积累的作用规律,并利用高通量组学的方法研究黄芩对干旱胁迫响应的转录调控机制,同时与光合生理、抗性生理研究相结合,揭示黄芩苷积累对干旱胁迫响应的分子生理生态机制,旨在为推进黄芩药材质量生态调控提供科学依据和技术支撑。主要研究结果如下:1.利用Design expert 8.05b软件Box-Behnken法对单因素下微波辅助提取黄芩药效成分进行响应面优化分析,得到最佳的提取条件:提取时间3.3 min,提取温度79.40℃,液料比32.60 mL/g,乙醇浓度66.30%。在该条件下,黄芩药效成分得率为19.79%,与软件预测得率差异较小,此方法为研究黄芩次生代谢产物合成机理奠定基础。2.通过人工模拟降雨对一、二年生盆栽黄芩长期干旱胁迫研究表明,重度干旱胁迫显著抑制黄芩根生长,而轻度干旱胁迫对黄芩根生长无显著影响。长期干旱胁迫对黄芩苷含量影响较小,但均可提高黄芩素含量。二年生黄芩在6月和9月黄芩苷含量出现双高峰,并且对干旱胁迫有明显的应答规律,该时期可能为黄芩次生代谢受水分调控的关键时期。此外,黄芩苷对干旱胁迫的响应规律具有短时性,可能是黄芩苷对干旱响应的次生代谢补偿机制。3.以二年生营养期和生殖期黄芩为研究材料,分别进行短期渐进性干旱胁迫和短期干旱胁迫及复水研究,结果表明:黄芩苷含量受干旱胁迫调控作用明显,轻、中度干旱胁迫阶段黄芩苷显著积累,重度干旱胁迫抑制了黄芩苷的合成,复水后,黄芩苷合成受抑制作用减弱。但干旱胁迫严重抑制营养期黄芩根生长。因此,生殖生长期可作为黄芩水分调控的潜在最佳时期。4.通过对黄芩光合生理、抗性生理与黄芩苷相关性分析表明,干旱胁迫前期黄芩Pn、Gs和Tr受影响较小,随着干旱胁迫时间延长,实际光化学效率ΦPSII降低,光合作用减弱,MDA开始大量积累,细胞膜受损,黄芩激活抗氧化酶系统,SOD、POD和CAT活性增强,渗透调节物Pro、SS和SP含量增加,此时黄芩苷和黄芩素含量均显著增加。但是在重度干旱胁迫下,Pn、Gs和Tr受抑制显著,同时非光化学猝灭系数NPQ显著增加,MDA含量持续升高,SOD、POD和CAT活性明显受到抑制,渗透调节物质SP含量降低,此时,黄芩苷含量降低,而黄芩素含量升高,表现出明显的黄芩苷与黄芩素代谢转化对干旱胁迫响应的补偿调节。5.通过对干旱胁迫黄芩次生代谢合成途径关键酶PAL、C4H、4CL和CHS活性研究表明:四种关键酶对黄芩苷合成发挥重要作用,其中与黄芩素相比,黄芩苷积累受合成途径关键酶影响较大。短期、轻中度干旱胁迫能够不同程度增强PAL、C4H、4CL和CHS酶活性,促进黄芩苷积累。长期、重度干旱胁迫会抑制4种酶的活性,黄芩苷合成受抑制。PAL和CHS对长期干旱胁迫黄芩苷调控作用明显;而C4H、CHS和PAL分别对营养期、生殖期黄芩苷调控作用明显。6.以18SrRNA为内参基因,构建sbPAL、sbC4H、sb4CL、sbCHS、sbCHI、sbFNS、sbUBGAT和sbGUS等8个黄芩苷合成途径关键酶基因对干旱胁迫表达时序图谱结果表明:干旱胁迫对关键酶的基因表达影响显著。总体表现为,短期干旱胁迫可促进关键酶基因表达,重度干旱胁迫会抑制基因表达,但对不同基因影响程度不同。其中,sbFNS对长期干旱胁迫黄芩苷调控作用明显;sbCHS和sbPAL基因表达模式分别与二年生营养期、生殖期黄芩药效成分积累模式相近,受干旱胁迫影响表达量变化显著,在黄芩苷合成过程中发挥重要作用,可作为黄芩质量调控重要候选基因。7.利用Illmina 4000测序平台对对照、轻度、中度和重度干旱胁迫黄芩根进行转录组测序分析:共获得93.59 GB数据,拼接注释得到57307个unigenes。有大量差异表达基因被富集到碳代谢、植物激素信号转导、苯丙烷代谢。包括大量活性氧清除基因、渗透调节物质合成基因,研究还发现,MYB（c49842.graphc0）和WRKY（c59576.graphc2）可能对干旱胁迫下黄芩苷积累具有重要的调控作用。综上,短期干旱胁迫可作为提高黄芩药材质量的有效手段,为精细化栽培提供技术参考。然而黄芩苷生物合成与积累并非受单一因子决定,而是光合、激素、酶活、基因表达等多因素共同作用的结果。后续研究将着重开展干旱胁迫下信号转导、转录调控与黄芩苷次生代谢途径之间的关系,阐明转录调控因子对关键酶基因表达的调控机理。