大鼠肝硬化腹水模型的制备及其在白蛋白药效学评价中的应用

肝硬化是由一种或多种原因长期、反复作用引起的慢性肝脏疾病，其病理学特征为：肝细胞变性、死亡，纤维结缔组织增生明显，典型的假小叶结构广泛形成。肝硬化腹水是肝硬化进入失代偿期的重要标志之一，主要形成原因是肝细胞坏死，肝小叶结构破坏、再生结节形成，肝脏合成蛋白的功能减退，引起蛋白分布改变和胶体渗透压降低，导致血液成分漏入组织间隙，组织液回收减少而渗入腹腔形成腹水，提示疾病预后不良。 肝硬化动物模型的制备是肝硬化发病机制研究及相关治疗药物研发的前提和基础，构建一种稳定、可靠、重复性好、模拟性强的肝硬化动物模型具有十分重要的意义。 常用于制备肝硬化动物模型的方法有四氯化碳法、酒精法、免疫法、胆总管阻塞法和多因素复合法等，其中四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）作为经典的肝毒物质广泛用于肝硬化模型（cirrhosis model,CM）的制备。CCl4制备肝硬化模型，一般用40～60%混合油溶液按照动物体重进行给药，每周2次，12-15周可形成肝硬化，但是CCl4肝毒性剧烈，单独使用时死亡率达30%-40%。我们在传统CCl4法的基础上进行改良，优化出CCl4联合苯巴比妥与酒精共同诱导的方法，规模化制备大鼠肝硬化腹水模型，为重组人血白蛋白（recombinant humanserum albumin,rHSA）和犬血白蛋白（plasma-derived canine serum albumin, pd-CSA）治疗肝硬化腹水药效学评价奠定基础。 本研究主要在优化制备大鼠肝硬化腹水模型的基础上进行白蛋白治疗效果的评价，为此，主要进行以下工作： （1）四氯化碳诱导大鼠肝硬化腹水模型的建立 为了优化最佳肝硬化腹水模型的制备方法，有效缩短建模周期、提高成模率、降低死亡率，分别运用CCl4法、CCl4+苯巴比妥法、CCl4+酒精法和CCl4+苯巴比妥+酒精法对大鼠进行诱导。正常对照组给予普通饮水，腹腔注射橄榄油；模型组分别给予不同饮用水处理，腹腔均注射CCl4-橄榄油混合溶液，注射剂量均为2ml/kg wt，每周注射两次，共12周。从给药第4周开始，隔1周对体重、腹围、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,AST）、白蛋白（albumin,ALB）和胶体渗透压（colloidosmotic pressure,COP）进行一次测定。 建模结束后，对各参数指标进行统计学分析，结果显示，各模型组大鼠的体重增长缓慢，腹围明显增加，ALT和AST显著升高，ALB和COP下降明显，与对照组比较，具有显著性差异。各模型组间参数指标进行比较，结果可以看出，CCl4+苯巴比妥+酒精组ALT和AST最先出现高峰峰值，ALB和COP在第8周时的下降程度已达到成模要求，其他各组均晚于CCl4+苯巴比妥+酒精组，说明CCl4+苯巴比妥+酒精组的方法对大鼠肝细胞损伤速度最快、最明显，有效缩短建模时间。大鼠肝组织进行病理学检查可以看出，对照组大鼠肝细胞排列整齐，各模型组均有典型的肝硬化病理特征出现，肝细胞排列紊乱，结缔组织增生，假小叶形成。比较各组的成模率和死亡率可以知道，CCl4+苯巴比妥+酒精组成模率为80%，均高于其他各组，死亡率20%低于其他建模组。综合分析结果表明，CCl4联合苯巴比妥与酒精的方法有效缩短建模周期，提高成模率，降低死亡率，利于肝硬化腹水模型的制备。 运用CCl4联合苯巴比妥与酒精的方法规模化制备大鼠肝硬化腹水模型，从给药第8周开始，对出现腹水阳性体征的大鼠进行血液指标的检测，根据成模标准筛选出符合药效学实验的大鼠模型。建模结束后，共获得90只符合成模标准的模型。用于rHSA和pd-CSA治疗效果的评价。 （2） rHSA治疗CCl4诱导肝硬化腹水模型的效果评价 rHSA是运用基因重组技术制备而成的，具有和人血白蛋白相同的分子生物学特性和免疫特性。rHSA的研制避免了血浆来源白蛋白的一些局限性和弊端。 将56只本研究第一部分制备的大鼠模型随机分为六组：阴性对照组大鼠给予10ml/kg wt模拟剂；不同剂量rHSA治疗组，根据临床上人血白蛋白的治疗剂量，确定了重组人血白蛋白各实验组的给药剂量分别为1.25ml/kg wt、2.5ml/kg wt、5ml/kg wt和10ml/kg wt，即0.25g/kg wt、0.5g/kg wt、1g/kg wt和2g/kg wt；阳性对照组给予10ml/kg wt的pd-HSA，给药两次，每次给药间隔18h，并且控制给药速度。完成给药后测定大鼠的腹围、尿量、COP和ALB，并对各参数给药前后变化量进行统计学分析，比较不同剂量的rHSA的治疗效果。 结果表明，20%rHSA治疗组大鼠的各项参数指标变化量与阴性对照组比较，具有明显的统计学差异，与20%pd-HSA比较，不具有统计学差异；rHSA组大鼠随着给药剂量的增加，各参数指标给药前后变化量随之增加，具有剂量依赖性。COP变化量与ALB的变化量呈正相关，腹围变化量与COP和尿量呈负相关，说明20%rHSA对大鼠肝硬化腹水有一定治疗作用。 （3） pd-CSA治疗CCl4诱导肝硬化腹水模型的效果评价 为了评价犬血白蛋白治疗肝硬化腹水的作用，随机将筛选的本研究第一部分的30只大鼠模型分为六组：四个不同剂量的10%pd-CSA治疗组，剂量分别为2ml/kg wt、4ml/kg wt、8ml/kg wt和16ml/kg wt，即0.2g/kg wt、0.4g/kg wt、0.8g/kgwt和1.6g/kg wt，阴性对照组和阳性对照组，分别给予16ml/kg wt生理盐水和10%pd-HSA（1.6g/kg wt）共注射两次，2h内完成注射，每次给药间隔18h。测量给药前后大鼠的腹围、尿量、COP和ALB的浓度，并对各参数指标给药前后变化量进行统计学比较，分析组间差异，明确pd-CSA的治疗作用。 实验结果显示，10%pd-CSA不同剂量组在治疗大鼠肝硬化腹水伴随低蛋白血症时，ALB浓度、COP水平和尿量增加的同时，腹围相应降低，各参数指标给药前后变化量与阴性对照组比较，具有明显的统计学差异，与pd-HSA比较不具有统计学差异。胶体渗透压给药前后变化量与腹围、白蛋白水平、尿量的变化呈良好的线性关系。说明10%pd-CSA对大鼠肝硬化腹水有一点的治疗作用。 rHSA和pd-CSA临床前药效学实验结果已作为相应药物临床试验申报材料，获得专家认可，为药物注册奠定了基础。