人类长寿基因SIRT1的表达调控机制研究

阐释寿命调控机制，实现延缓衰老、延长寿命的目的一直以来是人们关注的焦点及自然科学研究的热点。沉默信息调节蛋白2（silencing information regulator 2，Sir2），因其自身独特的生物学性质和功能，提示其将机体能量代谢、氧化状况与基因表达调控相耦联的重要作用而成为调控寿命基因研究的热点。 Sir2为染色体的异源结构组分，是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖性组蛋白去乙酰化酶。该家族成员基因结构高度保守。目前，对Sir2基因调控寿命的机制在酵母、线虫等低等动物中研究的比较深入，已发现在酵母细胞中，Sir2基因缺失会导致酵母寿命缩短而其高表达则可显著延长寿命；线虫Sirt2.1可感受机体营养摄取状态，通过Insulin（IGF-1）／PI-3K／Akt（PKB）／FOXO family同源通路实现对寿命的调控。作为进化过程中保守性很强的一个基因家族，针对Sir2基因在高等哺乳动物乃至人类寿命调控中的作用近年来引起了研究者的极大关注。 大量的研究成果证实Sir2在维持基因组的稳定性、DNA损伤修复、有丝分裂调控及抗凋亡等生命活动中发挥重要作用。近年来对于Sir2通过调控其下游作用元件发挥生理功能的研究比较广泛且深入，如人类SIRT1可通过使抑癌基因p53特异位点的赖氨酸残基发生去乙酰化作用从而负性调节其活性，但目前对调控SIRT1基因表达调控的机制研究却很少。 经过了近70多年，限制能量摄取（Calorie Restriction，CR）能够延年益寿已在自细菌直至高等哺乳动物得以证实，对其作用的确切分子机制目前所知甚少。现有研究发现在酵母、线虫、果蝇乃至小鼠中Sir2直接参与和介导了CR对寿命的调控过程。尽管CR延缓衰老、延长寿命的作用在动物模型中已得到有效验证，但要将此策略应用于人类必定存在很大困难。因此，利用能够模仿CR效应的生物制剂来实现对Sir2的激活作用，从而间接发挥类似CR的作用似乎更具现实意义。 最近有报道发现白藜芦醇（resveratrol，Res）可激活Sir2从而稳定了rDNA重复序列，使酵母寿命延长70％，同时体外实验发现Res可提高SIRT1对p53的去乙酰化作用。Res延长寿命的作用在线虫和果蝇中也得到了证实，且没有伴有其他遗传学操作所带来的如不育、侏儒等负面症状，且研究结果提示Res作用机制与CR相同。经验和动物实验已证实植物多酚具有预防衰老相关性疾病如癌症、神经退行性病变及心脑血管疾病发生等多重功效，但其作用的确切机制还是未知数。我们在前期的研究工作中发现天然植物提取物绞股蓝皂甙以浓度依赖性和时间依赖性方式明显拮抗谷氨酸诱导的氧化性神经毒性，证实天然植物提取物具有显著有效的抗衰老功能。 鉴于Sir2在抗损伤、抗癌和寿命调控中的重要角色，以及营养与环境因素可通过调控Sir2的活性发挥各种生理学作用，从而使深入探讨和阐明Sir2的表达调控机制显得尤为重要。为此，本课题进行了以下几个方面的研究： 第一部分CR和Res对人类SIRT1基因表达的影响 在低等生物和体外实验中发现CR通过激活Sir2来发挥延长寿命的作用，而Res是Sirtuin激活复合物（Sirtuin activating compounds，STACs），我们本部分实验工作中分析了CR和Res对人类SIRT1基因转录的作用。 我们选择了四种不同的人类细胞株，即HEK293，U2OS，HeLa和HepG2细胞，通过在培养过程中撤出血清或添加Res，培养12h后收集细胞，采用RT-PCR以及实时定量RT-PCR的方法，分析人类SIRT1基因mRNA水平。结果发现： 1．对数生长期的人类HEK293和HeLa细胞经CR处理后，其SIRT1基因mRNA水平明显高于对照，其升高幅度接近3倍； 2．在培养基中加入20μM Res能显著增加人类HepG2细胞和HeLa细胞SIRT1基因mRNA水平，其升高幅度接近3倍； 3．Res增强SIRT1基因转录在一定浓度范围内具有剂量依赖性。 以上研究结果表明CR和Res均能增强人类SIRT1基因转录，不同细胞具有类似的作用提示二者激活SIRT1基因转录作用无组织细胞特异性。这一研究结果为Res与CR在寿命调节中具有相同作用机制这一观点提供了直接的实验证据。 由于mRNA水平的升高主要通过促进转录启始活性而实现，DNA顺式作用元件是涉及基因转录调节的重要因素之一，是基因表达调控的重要研究内容。因此为进一步阐释CR和Res调控SIRT1表达的作用机制，定位其发挥作用的靶位点，我们着手对SIRT1基因的启动区进行分析。 第二部分人类SIRT1基因基本启动子分析 研究SIRT1基因表达的调控机制对于理解该基因的功能十分重要，目前关于SIRT1基因的表达调控机制尚不清楚。在本部分的实验工作中，我们对SIRT1基因的基本启动子进行了分析，为进一步分析外界因素对SIRT1基因的表达调控机制奠定基础。 首先采用MatInspector软件对NCBI数据库提供的人类SIRT1基因5’上游约1Kb序列进行分析，筛选顺式作用元件。根据基因组序列设计引物，利用不含启动子和增强子的报告基因分析系统pGL3-basic载体，将人类SIRT1基因编码序列上游1Kb范围内的系列截短片段分别克隆到pGL3-basic载体报告基因上游，以检测待测片段的启动子活性。构建了10种含人类SIRT1基因上游序列的荧光素酶表达载体，根据其5’端位置分别命名为：P-883，P-672，P-373，P-243，P-182，P-158，P-111，P-86，P-60，P-42；并进一步构建了四种突变型荧光素酶表达载体，即分别突变3个Spl核心序列的Spl-M1，Spl-M2和Spl-M3以及突变p53核心序列的P-158-p53（mut）。以PRL-TK为内参照质粒（pRL-TK质粒含有海肾荧光素酶报告基因，用来校正转染效率），以LipofectamineTM2000为转染试剂，将构建的表达载体以及阴性对照pGL3-basic分别瞬时转染U2OS和HEK293细胞株，24h后收集细胞，通过双荧光素酶报告基因检测系统定量分析启动子活性。通过siRNA抑制内源性基因表达的方法明确鉴定的转录调控因子的作用，并采用凝胶阻滞迁移实验（EMSA）进一步明确鉴定的顺式作用元件与反式作用因子之间的相互作用。取得了如下结果： 1．软件分析发现人类SIRT1基因缺乏典型的TATA box和CAAT box启动子序列，但具有NF-κB，Spl，AP2和CREB等转录因子结合位点。在转录起始位点约300bp范围内包含一个富含GC的区域，GC含量约为70％。 2．对载体P-883检测发现具有较强的启动子活性，表明人类SIRT1基因转录起始点上游883bp区域内含有该基因的启动调控序列。 3．经检测发现转录起始点上游-883bp至-243bp区域内不存在较强的正性或负性调控元件。而表达载体P-60与载体P-243相比较，其荧光素酶表达活性明显降低，降低幅度达到8倍，表明该区域内存在着人类SIRT1基因的主要表达调控元件。两种细胞中报告基因表达趋势相同，提示不存在组织特异性。5’缺失分析进一步将候选区域缩小到-86bp至-60bp之间和-182bp至-111bp之间。 4．-86bp至-60bp之间存在三个串联排列的Spl结合位点，提示Spl在人类SIRT1基因转录调控上起重要作用，突变分析证实3个Spl位点中远离转录起始点的Spl位点起决定性作用，该位点突变导致启动子活性明显下降，突变其它两个Spl位点对启动子的转录活性无显著影响；抑制内源性Spl表达降低了细胞SIRT1基因mRNA水平和启动子活性：EMSA分析表明Spl位点能特异性结合Spl蛋白。这些研究结果表明该区域的Spl位点是维持人类SIRT1基因转录所必需的重要调控元件。 5．-182bp至-111bp区域内存在一个p53结合模序，缺失和突变分析结果表明该序列在维持人类SIRT1基因的基本启动子活性上也发挥着重要作用。蛋白质相互作用分析进一步证实了人类SIRT1基因为p53蛋白的靶基因。此项研究结果提示p53蛋白与SIRT1之间具有着密切的调节机制。 第三部分p53在CR上调人类SIRT1基因表达中的作用 我们在第一部分实验中发现CR和Res明显提高了SIRT1基因的mRNA水平，两者参入SIRT1基因的转录水平调控。通过第二部分的实验研究在SIRT1基因启动调控区鉴定到一个功能性p53反应元件，提示人类SIRT1基因为p53蛋白的靶基因。对小鼠Sirt1基因的研究发现，CR上调小鼠Sirt1基因表达是通过其启动子区域p53结合位点介导的。序列比对分析发现人类SIRT1基因与小鼠Sirt1基因不同，其对应区域只存在一个p53反应元件的half site，而小鼠则是由两个half sites构成的一个完整的反应元件。为明确CR调控人类SIRT1基因表达的靶位点，我们对p53在CR调控人类SIRT1基因表达中所发挥的作用进行了深入分析。 我们选择了两组不同来源的p53阳性和p53阴性细胞株，分别为：成骨细胞来源的U2OS、Saos-2细胞株，和肝脏来源的HepG2、Hep3B细胞株。利用前述构建的含有p53结合序列的荧光素酶表达载体P-158、缺失该结合序列的荧光素酶表达载体P-111以及突变型载体P-158-p53（mut）分别瞬时转染U2OS和HepG2细胞，CR处理24h后收集细胞，通过双荧光素酶报告基因检测系统定量分析被检测片断的启动子活性。同时利用共转染野生型p53表达载体到p53阴性细胞株Saos-2、Hep3B细胞株的研究深入分析了内源性和外源性p53对CR上调SIRT1表达的影响。结果如下： 1．在表达野生型p53的HepG2和U2OS细胞中，CR能显著升高人类SIRT1基因mRNA水平，但在不表达p53的Hep3B和Saos-2细胞，CR对SIRT1基因的转录无显著作用，提示CR上调SIRT1基因转录需要p53的作用； 2．经CR处理后，表达载体P-158的荧光素酶相对表达活性显著升高，表明该区段内包含有CR发挥作用的DNA反应元件；而缺失p53结合序列的表达载体P-111以及突变型表达载体P-158-p53（mut），在CR处理和正常培养的对照条件下，其荧光素酶的相对表达活性没有明显变化，说明人类SIRT1基因启动子区域-158bp至-111bp之间的p53结合模序是CR上调SIRT1基因启动活性的调控元件。 3．在p53阴性细胞系Saos-2和Hep3B细胞中，CR处理和正常培养的对照条件下，表达载体P-158和P-111荧光素酶的相对表达活性没有明显变化。说明CR上调人类SIRT1基因转录需要p53和该基因启动子区域-158bp至-111bp之间的p53结合序列同时存在。 4．共转染野生型p53表达载体到p53阴性细胞能恢复CR对SIRT1基因的转录激活作用。 这些结果表明CR上调人类SIRT1基因转录是p53依赖性的，尽管人类SIRT1基因启动子区域只有1个half site，但也能发挥其转录调节作用。这是首次在细胞内发现p53的half site能与p53特异结合而发挥转录调节作用，从而进一步拓展了对p53转录调控作用的认识。 第四部分FOXO3a在CR调控人类SIRT1基因表达中的作用 我们在前期研究的基础上，进一步探讨了CR调控人类SIRT1基因所涉及的关键信号通路因子。有研究发现哺乳动物叉头转录因子FOXO家族和Sir2共同参与寿命的调节。人类FOXO家族位于Akt／PKB的下游，在胰岛素信号传递中发挥着关键性作用。研究发现FOXO是哺乳动物中Sirt1的直接和功能性的调控靶点，其可逆性乙酰化作用影响其转录调控功能。有报道发现在哺乳动物细胞中，CR以FOXO3a依赖方式，提高了小鼠Sirt1的转录水平。鉴于FOXO在介导CR调控Sirt1表达，以及其在抗癌、抗心血管疾病相关基因表达调控中所发挥的重要作用，我们采用RT-PCR，以及siRNA抑制内源性FOXO3a基因表达的方法进一步对FOXO家族成员在CR激活人类SIRT1转录过程中所发挥的作用进行了分析。 研究发现CR对人类SIRT1基因的转录激活作用为FOXO3a依赖性的，CR显著增强了FOXO3a基因的mRNA表达水平，并促进FOXO3a靶效应蛋白的表达；利用siRNA技术抑制内源性FOXO3a基因的表达，明显削弱了CR对SIRT1基因mRNA水平的上调效应以及对SIRT1基因启动区表达的激活作用。 本研究深入探讨了SIRT1基因的表达调控机制，为阐释寿命调节机制奠定了基础，为探索延长寿命的基础研究及药物开发提供了一定线索和依据。