红景天苷通过Wnt/β-catenin信号通路影响小鼠骨髓间充质干细胞向神经元细胞定向分化

大量研究表明，某些传统中药的单体能够诱导骨髓间充质干细胞（bonemarrow-derived mesenchymal stem cells， BMSCs）向神经细胞分化。红景天苷作为红景天的有效成分，具有较强的神经保护和抗氧化的功能。本研究利用传统的中药单体红景天苷(SD，salidrosides)诱导D1细胞系研究和探索红景天苷对骨髓间充质干细胞分化神经细胞的影响和信号转导机制。 实验选择体外培养的D1细胞系，分为空白组（D/F12完全培养基）和红景天苷诱导组（100μg/mL+D/F12完全培养基）。分别诱导细胞12、24、48和72h后，采用细胞免疫荧光化学染色方法检测神经细胞标志分子NSE、Map2、-Tubulin III和GFAP阳性细胞率。红景天苷和维甲酸诱导MSCs24h后，利用实时PCR技术检测NSE、Map2、-Tubulin III和GFAP基因表达；采用Western blot方法分析D1细胞诱导12、24、48和72h后，红景天苷对NSE和-Tubulin III蛋白表达的影响。 红景天苷诱导D1细胞后不同时间点NSE和Map2的阳性表达率分别在72h和48h表达最高，与空白组比较有差异具有统计学意义（P<0.05）；-Tubulin III的阳性率和GFAP阳性率分别在24h及12h表达丰度上调，与空白组比较差异具有统计学意义（P<0.01）；实时定量PCR结果显示，红景天和维甲酸诱导D1细胞组24h后，NSE、Map2和-Tubulin III均有表达.且红景天苷诱导组表达显著优于维甲酸诱导组，与空白组相比较有统计学意义(P<0.01)；Western blot结果：随诱导时间NSE和-Tubulin III表达逐渐上调；其中72h表达显著上调，与空白对照组比较有统计学意义(P<0.05)。该结果表明红景天苷能促进骨髓间充质干细胞向神经细胞定向分化。 在研究Wnt/β-catenin信号通路介导红景天苷的作用方式和分子机制中，实验选择体外培养的D1细胞系，分为空白组（D/F12完全培养基）和红景天苷诱导组（100μg/mL+D/F12完全培养基）分别诱导细胞12、24、48和72h后，采用细胞免疫荧光化学染色方法检测β-catenin和Gsk-3β的阳性细胞率。利用红景天苷分别诱导MSCs1，2，8，12，和24h后，利用实时PCR技术检测Wnt/β-catenin信号通路的关键信号分子wnt3a、wnt5a、wnt11a、Axin1、Axin2、Lrp5/6和Gsk-3β mRNA的基因表达；采用Western blot方法分析D1细胞诱导12、24、48和72h后，β-catenin和Gsk-3β蛋白的表达;加入wnt信号的特异性阻断剂DKK1后，分析wnt信号的关键分子β-catenin的蛋白表达。红景天苷能诱导MSCs定向分化为神经元样细胞，诱导24h时β-catenin的阳性率可达55.76%，与其他组和对照组比较差异具有统计学意义（P<0.01），诱导24和48h后Gsk-3β的阳性率与其他时间和对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。实时PCR检测结果显示，红景天苷诱导MSCs不同时间能促进Wnt/β-catenin信号通路中关键信号分子Wnt3a、Axin2、Lpr6和Gsk-3β mRNA的表达，诱导不同时间wnt3a、wnt5a、wnt11a、Axin1、 Axin2、Lrp5/6和Gsk-3βmRNA的表达不尽相同。Western blot结果表明，红景天苷诱导MSCs12h和24h时β-catenin蛋白的表达明显上调，且与其他组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；随着作用时间的延长，Gsk-3β蛋白的表达增加且差异具有统计学意义(P<0.05)；加入wnt特异性阻断剂DKK1后β-catenin蛋白几乎不表达。表明红景天苷具有诱导BMSCs定向分化为神经元样细胞的功效，且Wnt/β-catenin信号通路与其增殖与分化调控密切相关。