Th17细胞相关细胞因子IL17和IL22抗乙肝病毒复制的体外研究

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)属嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae),基因组长约3.2kb,为部分双链环状DNA,可引起人的急、慢性肝炎。长期慢性乙肝病毒感染是肝纤维化,肝硬化及肝癌的高危因素。慢性乙型病毒性肝炎发病机制复杂,宿主的免疫调节紊乱是导致病毒不能有效清除,引起慢性炎症,病情迁延不愈的重要原因。众多的细胞因子不仅参与了机体的免疫调节,并且具有直接抑制病毒复制的作用。例如在细胞实验和动物模型中已经证实,白细胞介素(interleukin, IL)6、IL12和IL18等均具有非细胞毒性的抑制乙肝病毒复制的作用。IL12和IL2也已有应用于慢性乙型病毒性肝炎患者的临床病例的报道。IL17和IL22是辅助性T细胞17(T help cell17,Thl7)主要效应细胞因子。目前很多研究证实Thl7参与到急性或慢性肝损害的炎症反应中。有研究表明,在慢性乙肝患者中,血清中IL17的浓度和Th17的数量与血清中HBV DNA水平呈负相关；血清中HBV DNA水平与肝脏炎症水平呈正相关,而IL22水平与肝脏炎症水平呈负相关。Th17细胞的细胞因子IL17和IL22可能具有抑制HBV复制的作用。实验选取了在可持续复制HBV的肝癌细胞系HepG2.2.15中进行验证。 抗粘病毒蛋白A(MxA)和2’,5’寡腺苷酸合成酶(OAS)是两个重要的抗病毒蛋白,其具有抗多种病毒复制的作用,包括HBV. MxA在胞浆内与病毒的核糖核蛋白复合物直接结合,在病毒侵入细胞的早期抑制病毒复制。OAS可使ATP聚合成2,5-寡腺苷酸,以激活细胞内核酸酶,降解病毒mRNA,从而抑制病毒蛋白合成。在本实验中,进一步研究了IL17导致的HBV抑制作用与MxA和OAS的关系。 第一部分IL17在肝癌细胞系HepG2.2.15中抑制HBV复制的研究 目的：观察IL17在可持续分泌HBV的肝癌细胞系HepG2.2.15(?)中抑制HBV复制的作用。 方法：分别用不同浓度(4ng/ml、1ng/ml和250pg/ml)的IL17和anti-IL17R Ab (anti-IL17R antibody,anti-IL17R Ab)干预HepG2.2.15细胞,CCK8比色法检测细胞的增殖情况。分别用含有1ng/ml IL17,1ng/ml抗IL17抗体和(?)1μg/ml阿德福韦酯的细胞培养液作用于HepG2.2.15细胞,加药后3d收集培养上清液,5d收集上清液和细胞,用Real-time PCR方法检测上清和细胞内HBV DNA、(?)电化学发光方法检测细胞上清的HBsAg和HBeAg。应用单因素方差分析(One-way analysis of variance,ANVOA)和Dunnett's test用来比较各组间的差别。 结果：(1)不同浓度水平的IL17组和anti-IL17R Ab组间及与空白对照组比较HepG2.2.15细胞CCK8值均无明显差别(表1-2,P>0.05)。IL17对细胞的增殖无抑制和促进作用。 (2)IL17组细胞内HBV DNA水平明显低于正常对照组(6.79±0.15,7.14±0.13,P<005)；anti-IL17R Ab组细胞内HBV DNA水平明显高于正常对照组(7.47±0.16,7.14±0.13,P<0.05)：阿德福韦酯组细胞内HBVDNA水平明显低于正常对照组、IL17组和anti-IL17R Ab组(6.11±0.36,P<0.05)。 (3)3d和5d时IL17组细胞上清液中HBV DNA水平与正常对照组间无明显差异(4.67±0.31,4.47±0.34,P>0.05；4.70±0.34,4.57±0.38,P>0.05)；3d和15d(?)anti-IL17R Ab组细胞上清液中HBV DNA水平明显高于正常对照组(5.00±0.21,4.47±0.34,P<0.05；5.10±0.21,4.57±0.38,P<0.05)；3d和5d时阿德福韦酯组细胞上清液HBVDNA水平明显低于正常对照组、IL17组和anti-IL17R Ab组(3.59±0.49,P<0.05；3.35±0.44,P<0.05)。 (4)IL17组3d时细胞上清液中(?)HBsAg水平与正常对照组比较无明显差异(9.71±1.55,10.72±0.95,P>0.05),5d时细胞上清液中(?)BsAg水平低于正常对照组(7.56±0.60,9.19±1.20,P<0.05)；anti IL17R Ab组3d时细胞上清液HBsAg水平高于正常对照组(12.78±0.96,10.72±0.95,P<0.05),5天时细胞上清液HBsAg(?)水平与正常对照组无明显差异(10.72±1.16,9.19±1.20,P>0.05)；3d和5d阿德福韦酯组细胞上清液HBsAg水平与正常对照组比较无明显差异(9.41±1.65,10.72±0.95,,P>0.05；9.78±1.23,9.19±1.20,P>0.05)。 (5)3d和5d IL17组细胞细胞上清液中HBcAg水平低于正常对照组(34.90±3.68,43.10±5.46,P<0.05；24.92±6.18,43.95±6.64,P<0.05);3d和(?)5d anti-IL17R Ab组细胞上清液HBeAg水平与正常对照组比较无明显差异(45.07±4.33,43.10±5.46,P>0.05；48.31±9.49,43.95±6.64,P>0.05);3d和5d阿德福韦酯组细胞上清液HBeAg水平与正常对照组比较无明显差异(40.56±6.12,43.10±5.46,P>0.05;41.51±4.88,43.95±6.64,P>0.05)。 (6)4ng/ml,lng/ml,250pg/ml IL17组间比较,细胞上清液中HBV DNA, HBsAg,HBeAg,细胞内HBV DNA水平均无明显差异(表1-6,P>0.05)。第5天IL17可降低细胞上清液HBsAg水平,第3天IL17无法降低HBsAg水平；第5天IL17对细胞上清液HBeAg的抑制率43.31%,第3天对细胞上清液HBeAg的抑制率为19.04%。 结论：IL17对HepG2.2.15细胞增殖无抑制和促进作用。IL17可在不产生细胞毒性作用的情况下,对HepG2.2.15细胞系内的HBV复制产生抑制作用。IL17的抑制作用在250pg/ml至4ng/ml浓度范围内无浓度依赖性,有时间依赖性。IL17与阿德福韦酯间抗病毒作用机制不同。 第二部分IL22在肝癌细胞系HepG2.2.15中抑制HBV复制的研究 目的：探究IL22在可持续分泌HBV的肝癌细胞系HepG2.2.15中抑制HBV复制的作用。 方法：分别用含有不同浓度(4ng/ml、1ng/ml和250pg/ml)的IL22和抗IL22抗体(anti-IL22R antibody,anti-IL22R Ab)干预HopG2.2.15细胞,CCK8比色法检测细胞的增殖情况。分别用含有1ng/ml IL22, lng/ml anti-IL22R Ab和(?)1μg/ml阿德福韦酯的细胞培养液作用于HepG2.2.15细胞,加药后3d收集培养上清液,5d收集上清液和细胞,用Real-time PCR方法检测上清和细胞内HBV DNA、电化学发光方法检测细胞上清的(?)BsAg和HBeAg。应用(?)ANVOA和Dunnett's test用来比较各组间的差别。 结果：(1)不同浓度水平的IL22组和(?)anti-IL22R Ab组间及与空白对照组比较HepG2.2.15细胞CCK8值均无明显差别(表2-1,P>0.05)。IL22对细胞的增殖无抑制和促进作用。 (2)IL22组细胞内HBV DNA水与正常对照组比较无明显差异(7.28±0.26,7.14±0.13,P>0.05)；anti-IL22Ab组细胞内HBV DNA水平与正常对照组比较无明显差异(7.24±0.17,7.14±0.13,P>0.05)。 (3)3d和5d时IL22组细胞上清液中HBV DNA水平与正常对照组间无明显差异(4.87±0.63,4.47±0.34,P>0.05；4.68±0.70,4.57±0.38,P>0.05)；3d和5d时anti-IL22R Ab组细胞上清液HBV DNA水平与正常对照组比较无明显差异(4.70±0.50,4.47±0.34,P>0.05；4.77±0.33,4.57±0.38,P>0.05)； (4)3d和5d时IL22组细胞上清液中HBsAg水平与正常对照组比较无明显差异(11.07±1.15,10.72±0.95,P>0.05；8.99±0.42,9.19±1.20,P>0.05)；3d和5d时anti-IL22R Ab组细胞上清液HBsAg水平与正常对照组间无明显差异(9.80±1.50,10.72±0.95,P>0.05；10.27±1.24,9.19±1.20,P>0.05)。 (5)3d和5d时IL22组细胞细胞上清液中HBeAg与正常对照组水平无明显异常(45.42±6.80,43.10±5.46,P>0.05；37.80±7.55,43.95±6.64,P>0.05)：3d和5d时(?)anti-IL22R Ab细胞上清液HBeAg水平与正常对照组比较无明显差异(40.06±4.29,43.10±5.46,P>0.05：39.45±6.99,43.95±6.64,P>0.05)。 结论：IL22(?)HepG2.2.15细胞增殖无明显抑制和促进作用,对HepG2.2.15细胞系内的HBV复制无明显抑制作用。 第三部分IL17对HepG2.2.15细胞内部分抗病毒蛋白基因转录水平的影响 目的：探究IL17对HepG2.2.15细胞内部分抗病毒蛋白基因转录水平的影响。探究其与IL17抗HBV作用之间的关系。 方法：1ng/ml IL17干预HepG2.2.15细胞。选取部分抗病毒蛋白如抗粘病毒蛋白A(MxA)、2’5’寡腺苷酸合成酶(OAS)、干扰毒刺激基因因子3(ISGF3)、信号转导与转录活化因子1(STAT1)和信号转导与转录活化因子2(STAT2),Reak-timeRT-PCR方法检测IL17作用72h后HepG2.2.15细胞内OAS、STAT1、STAT2、1SGF3和MxA基因转录产物mRNAQ水平变化,以β-actino基因(?)mRNA作为检测内参照。用(?)MxA siRNA和IOAS siRNA诱导沉默HepG2.2.15细胞内MxA和OAS基因转录,Real time RT-PCR方法检测IL17作用下MxA和OAS基因转录产物mRNA水平变化,Real timePCR方法检HepG2.2.15细胞内HBV DNA水平变化。应用ANVOA和(?)Dunnett's test用来比较各组间的差别。 结果：(1)IL17作用后HepG2.2.15细胞内MxA和OAS转录水平与对照组比值为16.56(P<0.05)和19.88(P<0.05)；STAT1, STAT2, ISGF3转录水平与对照组比值为1.67(P>0.05)、1.98(P>0.05)和1.93(P>0.05) (2) MxA siRNA可有效沉默IL17诱导的MxA转录(沉默效率为82.63%),同步检测(?)MxA siRNA组细胞内HBV DNA水平较对照组明显升高(7.09±0.21,6.76±0.28,P<0.05)。 (3) OAS siRNA可有效沉默IL17诱导的OAS转录(沉默效率为81.07%),同步检测(?)OAS siRNA组细胞内HBV DNA水平较对照组明显升高(7.19±0.13,6.76±0.28,P<0.05) 结论：IL17作用可以诱导HepG2.2.15细胞内MxA和(?)OAS基因活跃转录,并产生抑制HBV复制的作用。