人参皂苷Rb1对AD细胞模型大电导钙激活钾通道变化机制的影响

研究背景: 人参皂苷Rb1（G-Rb1）是近年研究较多的一种人参单体,现代药理学研究表明G-Rb1具有中枢神经兴奋、抗衰老、抗氧化、提高免疫力和增强记忆力、促进蛋白质、DNA和RNA合成等作用,是人参作用于神经系统和促智的主要有效成分之一。 关于Aβ（25-35）的神经毒性作用已有广泛报道,但就其毒性作用机制仍有很大争议。近年来已提出一些毒性机制的假说,例如对细胞膜原有通道的毒性作用,在细胞膜上形成新的离子通道,细胞的氧化应激损伤以及细胞内Ca2+超载等。其中有关Aβ25-35通过影响BKCa通道功能并进而引致钙内流,最后出现神经元兴奋性改变和细胞死亡的学说,受到了人们的普遍关注。 研究目的: 本课题以急性分离的新生7到14天的SD大鼠的皮层神经元为靶标,运用Aβ25-35作用于皮层神经元形成AD细胞模型,研究阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease,AD）细胞的大电导钙激活钾通道(BKCa)改变及人参皂苷Rb1对Aβ25-35诱导的皮层神经元上BKCa的影响,初步探讨G-Rb1保护神经元的作用与调节神经元上BKCa通道的活动是否存在联系。 研究方法: 将7到14天SD大鼠断头取脑,急性分离皮层神经元,用倒置显微镜进行形态学观察。实验分为Aβ25-35组（终浓度为5,10,20,40μmol/L）,人参皂苷Rb1预处理组（终浓度为0.5,1,2,4μmol/L）、治疗组(Aβ25-35+人参皂苷Rb1)和空白对照组。采用膜片钳技术细胞贴附式记录单通道BKCa电流并用TAC分析软件计算BKCa通道的平均开放时间、平均开放概率、电导值和电流幅度,选择Ap造模最佳浓度以及人参皂苷Rb1预处理最佳浓度,观察G-Rb1对AD细胞的作用。数据以（?）±s表示,用SPSS11.5进行统计分析。 研究结果: 1所记录通道的电活动特性符合BKca通道的特点,表现为大电导、K+选择性、电压依赖性和Ca2+依赖性。 2本实验选择制备AD细胞模型的Aβ25-35最适宜浓度为20μmol/L。显微镜下观察各组细胞,发现加入水溶性Aβ25-35的各浓度组细胞状态均比未加Aβ25-35的空白对照组差,且随浓度的提高,细胞损害有加重的趋势。 实验结果还发现,5μmol/L Aβ25-35可增加BKCa通道的平均开放时间（P＜0.05）,对神经元由有保护的作用;10μmol/L组与空白对照组比较平均开放时间无统计学意义;20μmol/L Aβ25-35可降低BKCa通道的平均开放时间（P＜0.05）,明显抑制BKCa通道开放;40μmol/L Aβ25-35组镜下可见细胞损伤严重,封接后细胞无法维持,很快破裂死亡,膜稳定性差,图形无法作统计。结合BKCa通道的平均开放时间和形态学观察结果,故最后选择Aβ造模的浓度为20μmol/L。 3本实验选择的人参皂苷Rb1对皮层神经元最佳预保护浓度为4μmol/L。 与空白对照组相比,G-Rb1预处理组细胞存活时间长,细胞损伤相对为小,易封接。 实验结果显示,1、2μmol/L Rb1组的BKCa通道平均开放时间有所提高,但无统计学意义（P＞0.05）,4μmol/LRb1组BKCa通道较空白对照组平均开放概率和开放时间均明显升高（P＜0.05）;8μmol/LRb1组BKCa通道长程猛烈开放,造成细胞膜稳定性不好,图形无法作统计学计算。提示4μmol/L Rb1可上调BKCa通道活性。 4人参皂苷Rb1可拮抗Aβ25-35对BKCa通道的神经毒性作用镜下见加4μmol/L人参皂苷Rb1组均比不加人参皂苷Rb1组的模型组存活时间长,封接容易,细胞损伤相对为小,但较空白对照组差;BKCa通道的平均开放时间和开放概率均明显升高（P＜0.05,P＜0.01）,提示人参皂苷Rb1组可激活BKCa通道,对抗Aβ的毒性作用。 结论: 以上研究结果提示,不同浓度的水溶性Aβ25—35对神经元内BKCa通道的活性有不同的影响,20μmol/L Aβ25—35可下调神经元内BKCa通道的活性,诱导形成AD细胞。由此我们推测,BKCa通道是Aβ在脑内的可能作用靶点,此效应所导致的神经元损伤可能是Aβ的神经毒性作用机制之一。4μmol/L人参皂苷Rb1可激活BKCa通道,对抗Aβ25—35的毒性作用,从而保护神经细胞,延缓AD发生、发展。