樱桃S基因型及自交（不）亲和机制研究

欧洲甜樱桃（P.avium L）．是重点发展的早熟果树，其自交不亲和性是影响生产的重要因素。现有主栽品种多数不知道S基因型。确定S基因型，对配置授粉树、选配杂交亲本、探讨自交不亲和的分子机制及选育自交亲和品种都非常重要；中国樱桃（P.pseudocerasus L.）具有自交亲和、果实发育期短、部分类型树体矮化等特殊的重要资源性状，对培育自交亲和、早熟、矮化的优良品种有重要价值。本研究主要利用S基因特异PCR、田间杂交座果率调查、花粉管生长观察和等电聚焦凝胶电泳等手段，克隆了甜樱桃品种的S基因，确定了山东省主栽品种的S基因型，探讨了甜樱桃自交不亲和及中国樱桃自交亲和的机制，建立了确定S基因型的技术体系，可直接用叶片DNA，根据S基因特异PCR片段大小来确定S基因型。主要结论如下： 1．根据蔷薇科S基因核酸序列的高度保守区C2和RC4区的序列设计引物PruC2和PruC4R，对叶片基因组DNA做S基因特异PCR扩增，克隆测序各S基因的扩增片段并在genebank上搜索。结果证明，在电泳中显示的相同大小的PCR片段，是同一种S基因。各S基因扩增片段大小分别是：S1为676-677bp，S3为761-762bp，S4为943-944bp，S6为456bp。首次阐明部分S基因扩增片段的核酸序列及大小。 2．建立了一套技术体系来鉴定基因型未知品种的S基因型。用PruC2和PruC4R专一引物对叶片DNA做PCR扩增，根据扩增片段的大小来确定该片段是那种S基因，确定该品种的S基因型。依据该方法，对现有主栽品种确定了S基因型。红灯、早红宝石、红艳、先锋是S1S3，抉择、那翁、红丰、外引7号为S3S4，大紫是S1S6，长把红是S1S4，养老是S3S6，斯太拉是S3S4。 3．田间杂交座果率表明，S基因型相同的品种间杂交，表现杂交不亲和，不能互为授粉树。不同S基因型的品种间杂交，表现杂交亲和，但亲和花粉所携带的S基因的种类和数量不是影响座果率高低的因素。 4．通过分析现有品种的S基因型，发现各S基因出现的频率不同，以S3频率最高，为42.31％；S1和S4中等，分别为23.08％、26.92％，S6最小，为7.69％；S2和S5没有出现。因此，把S3称为高频S基因，S1和S4为中频S基因，S6为较低频S基因，S2和S5为低频S基因。 5．樱桃参试品种用RAPD聚类分析方法，分成8类。同一类中的品种亲源关系较近，都共有一个相同的S基因，甚至S基因型相同，是S基因的遗传造成。但遗传距离较远的品种，多共有高频的S3基因，不只是遗传因素所致，还可能与S3基因在育种中有选择优势有关。 6．甜樱桃品种抉择、早红宝石、养老等自花授粉及杂交授粉表明，授粉后24-30h，亲和及不亲和花粉管生长没有差异，都能萌发并到达花柱上、中部；授粉后48-77h，亲和及不亲和花粉管生长表现明显差异，亲和花粉管不断延伸，进入子房。而不亲和花粉管进入花柱中、下部，在中、下部生长受抑制，停止生长，有的表现顶端膨大、 陈晓流：樱桃S基因型及自交（不）亲和机制研究 破裂，但多数形态正常。 7．甜樱桃自交不亲和的机制是石基因在花柱表达产生 S－RNase的量很丰富，使卜 RNase能够抑制自体花粉管生长，使不亲和花粉管在花柱中、下部生长受抑制而停止生 长，不能进人子房完成授粉受精的过程。 8．首次阐明中国樱桃自交亲和的机制是：花柱中可溶性蛋白含量明显比SI的甜樱 桃的低，RT－PCR显示S基因在花柱中表达，但IEF－PAGE上分离到的S—RNase的量很 少，即S基因表达产生的S－RNase量太少，使S－RNase不能抑制自体花粉管的生长， 导致自交亲和，自交座果率达25％。 9．RAPD聚类分析和S基因的核酸序列比较都表明，中国樱桃和酣樱桃的遗传距离 很远，把它们划归两个类。但这两个种的部分品种间杂交，表现出种间杂交亲和。 10．对叶片基因组 DNA做 S基因特异扩增，甜樱桃各品种得到两条不同的扩增带， 说明基因组中有两种不同的s基因；中国樱桃只得到一条扩增带，说明基因组中有一 种S基因。 11．把中国樱桃的 S基因型定为 S；m，SM表示花柱部分的突变使 S基因在花柱中 不表达或表达水平低。 12．中国樱桃和甜樱桃基因组中 S基因比花柱中相应的叩NA片段长，表明樱桃 S 基因中有内含子。