破骨细胞形成的分子机制及溶骨性病变中破骨细胞的局部调控

第一部分破骨细胞形成的分子机制 目的骨是一种不断更新的组织,骨重建贯穿生命过程的始终。生理条件下,骨吸收与骨再生之间保持平衡状态。如果这种平衡被打破就会发生骨硬化症、骨质疏松症以及局灶性骨溶解等疾病。破骨细胞(osteoclast, OC)是肌体中最主要的骨吸收的效应细胞;多种炎性及非炎性的骨与关节的病变都与OC代谢异常有关。对于OC形成及骨吸收活性调控的分子机制目前还存在广泛的争议。本实验拟通过体外实验,探讨除RANKL诱导的OC形成机制外,是否存在其它的OC形成的机制。 方法将RAW264.7细胞系、小白鼠及人的外周血单个核细胞(PBMCs)在玻璃盖玻片以及象牙磨片上作体外培养;在巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)存在的条件下,分别加入不同剂量的核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα, TNFα)以及LIGHT (homologous to lymphotoxins, exhibits inducible expression, andcompetes withHSV glycoprotein D for HVEM, a receptor expressed by T lymphocytes),并分别加入骨保护素(osteoprotegerin, OPG)、抗TNFα受体中和抗体以及抗HVEM中和抗体、抗L TβR中和抗体和LIGHT的饵受体DcR3。于培养结束后将部分细胞固定并进行抗酒石酸磷酸酶(Tartrate Resistent Acid Phosphatase, TRAP)、玻璃体结合蛋白受体(Vitronectin Receptor, VNR)以及丝状肌动蛋白环(F-actin ring)染色;部分象牙磨片经超声处理去除表面细胞后分别进行表面喷涂金粉或者甲苯胺蓝染色,电子显微镜或光学显微镜观察象牙磨片表面虫噬样骨吸收陷窝的形成。 结果:⑴、在M-CSF存在的条件下向培养系统中单独加入TNFα或者LIGHT,RAW264.7细胞、小鼠及人PBMCs体外培养形成大量TRAP以及VNR阳性的多核细胞(Multi-nucleated cells, MNCs),这些细胞肌动蛋白环(F-actin ring)染色阳性;扫描电镜及光学显微镜观察,在上述培养条件下象牙磨片上见到虫噬样骨吸收陷窝。⑵、RANKL拮抗剂OPG未能抑制TNFα、或者LIGHT诱导的TRAP+、VNR+多核细胞的形成以及虫噬样骨吸收陷窝的形成;而抗TNFα受体I和II的中和抗体完全阻断TNFα诱导的TRAP+、VNR+多核细胞形成,DcR3、抗TNFα受体II的中和抗体则抑制LIGHT诱导的TRAP+、VNR+多核细胞的形成。⑶、在M-CSF存在的条件下,同时加入小剂量的RANKL和LIGHT,象牙磨片上骨吸收陷窝的面积比单独加入同等剂量的RANKL或LIGHT时的面积显著增多。 结论:TNFα和LIGHT均能够不依赖于RANKL而直接诱导OC的分化并支持OC的骨吸收活性。LIGHT对RANKL诱导的OC介导的骨吸收具有协同作用。病理状态下,低水平的TNFα以及LIGHT可能通过这种协同作用而参与OC所介导的骨吸收。 第二部分溶骨性病变中破骨细胞的局部调控 目的人工假体无菌性松动、Paget’s病以及骨肿瘤等疾患都存在明显的局灶性溶骨性病变;作为骨吸收的效应细胞的破骨细胞(osteoclast, OC)的分化、活性的调节的失衡是局灶性骨溶解的关键。本实验拟通过体外实验,探讨上述疾患中OC分化及其骨吸收活性的局部调控。 方法分别取类无菌性松动的人工假体周围假膜组织、Paget’s病及Paget’s骨肉瘤病灶标本,利用酶消化法、组织块培养法以及免疫磁珠法分离组织内巨噬细胞以及成纤维母细胞样基质细胞(Fibroblast-like stromal cells, FLSCs)。向巨噬细胞体外培养系统中分别加入M-CSF、RANKL和TNFα,于培养结束后检测TRAP+、VNR+多核细胞的形成以及象牙磨片上虫噬样骨吸收陷窝的形成;将各种组织来源的FLSCs体外培养并传代后,部分细胞用于RT-PCR检测RANKL及TNFαmRNA的表达,另一部分细胞与人PBMCs共同培养,分别建立接触性同培养系统和非接触性共培养系统,并分别加入RANKL的拮抗剂以及抗TNFα中和抗体,观察TRAP+、VNR+多核细胞的形成以及虫噬样骨吸收陷窝的形成。 结果:⑴在M-CSF存在的条件下,向培养系统中加入RANKL,无菌性松动的假体周围假膜组织来源的巨噬细胞的体外培养体系中观察到TRAP+、VNR+的多核细胞(MNCs),象牙磨片上观察到虫噬样骨吸收陷窝的形成。⑵无菌性松动的假体周围假膜组织、、Paget’s病以及Paget’s骨肉瘤病灶来源的FLSCs均表达RANKL和TNFαmRNA;并且在M-CSF存在的条件下,FLSCs与PBMCs的接触性与非接触性共培养系统中均观察到TRAP+、VNR+的多核细胞,象牙磨片上观察到虫噬样骨吸收陷窝的形成;与接触性共培养系统相比较,非接触性共培养系统中多核细胞及骨吸收陷窝的数量均显著减少。向假膜组织来源的FLSCs-PBMCs共培养系统中分别加入RANKL的拮抗剂OPG或者抗TNFα中和抗体,二者均显著抑制但是未能完全阻断TRAP+多核细胞以及虫噬样骨吸收陷窝的形成;二者同时加入,则完全阻断TRAP+多核细胞以及骨吸收陷窝的形成。向Paget’s病病灶以及Paget’s骨肉瘤病灶来源的FLSCs-PBMCs共培养系统中加入OPG完全阻断TRAP+多核细胞以及虫噬样骨吸收陷窝的形成;而向共培养系统中加入抗TNFα中和抗体后,TRAP+多核细胞以及骨吸收陷窝的面积减少,但是差异不具有显著性。 结论:无菌性松动假体周围假膜组织中的巨噬细胞可以作为OC前体细胞通过RNAKL机制分化成为具有骨吸收活性的成熟的OC;假膜组织中的FLSCs通过表达RANKL以及TNFα支持OC的分化并支持OC的骨吸收活性;、Paget’s病以及Paget’s骨肉瘤病灶中的FLSCs通过表达RANKL支持OC形成。