黄芪水提物促肾脏水钠排泄及肾脏保护作用的细胞分子机制研究

水肿和蛋白尿是肾脏疾病常见的临床表现。内髓集合管（IMCD）位于肾单位的终末端，决定最终的尿钠浓度和尿量。心房利钠肽（ANP）与IMCD细胞ANP受体结合后，通过cGMP发挥利钠、利尿效应，同时，cGMP能被磷酸二酯酶5（PDE5）灭活而失去作用，PDE5活性异常增高，cGMP灭活过多，导致ANP抵抗，是肾病水肿形成的重要病理机制。此外，足细胞损伤是蛋白尿产生和肾小球硬化的关键，足突-基底膜粘附分子α-dystroglycan和α3β1整合素结构和功能受损是足细胞从基底膜剥离和脱落的重要因素。 黄芪是治疗肾脏疾病的常用中药，文献报道黄芪能排钠利尿及减轻蛋白尿、保护肾功能，但其作用机制目前尚未完全阐明。本文首次采用临床试验、动物实验及体外细胞实验从ANP-cGMP-PDE5信号通路角度全面阐明了黄芪水提物（ARE）促肾脏水钠排泄作用的分子机制；此外，本文还在整体、细胞、分子三个层次，从足细胞粘附分子α-dystroglycan和α3β1整合素角度深入研究了ARE对足细胞损伤的保护作用及其分子机制，为肾脏疾病的治疗提供了新思路。 第一部分黄芪水提物促肾脏水钠排泄的作用及分子机制 一、黄芪水提物促健康人尿钠排泄的临床试验 目的：研究黄芪水提物（ARE）对健康人的利尿利钠作用并探讨其机制。 方法：采用双盲交叉试验设计，12名健康男性志愿者口服生理盐水（10ml／kg）扩容后，随机分为黄芪水提物（ARE）组（0.3g／kg）和安慰剂组，观察给药后4小时内尿量、尿钠排泄量(UNaV)、尿氯排泄量(UClV)、尿钠排泄分数(FENa)、血浆ANP浓度（pANP）、尿cGMP排泄量(UcGMPV)及UcGMPV／pANP变化，经两周洗脱期后进行交叉试验。 结果：与安慰剂相比，黄芪水提物（ARE）显著增加健康志愿者UNaV，在服药后1.5h和2h分别增加43％和73％，在2h达高峰（0.30±0.05 vs.0.21±0.02mmol／min，P＜0.05），4h作用基本消失。ARE还能明显增加FENa和UClV，均在2h达高峰（P＜0.05）。ARE显著增加UcGMPV、UcGMpV／pANP比值（P＜0.05），此外，UcGMpV与pANP相关关系显示，ARE显著改善ANP敏感性（P＜0.05）。ARE对血浆肾素活性、血管紧张素Ⅱ和醛固酮浓度及平均动脉压（MAP）、肌酐清除率（Ccr）均无明显影响（P＞0.05）。 结论：本研究首次采用前瞻性、双盲、随机对照临床试验证实黄芪水提物（ARE）能显著促进健康人尿钠排泄，其机制可能与ARE增加肾脏ANP敏感性有关。 二、黄芪水提物改善阿霉素肾病大鼠ANP抵抗的作用及机制研究 目的：探讨黄芪水提物（ARE）改善阿霉素肾病大鼠ANP抵抗的作用及机制。 方法：一次性尾静脉注射阿霉素（6mg／kg）建立肾病综合征模型，将大鼠随机分为正常对照组（Norm），阿霉素肾病组（ADR），ADR+黄芪水提物组(2.5g·kg-1·d-1)（ARE）及ADR+苯那普利组(10mg·kg-1·d-1)（ACEI），每组12只。用药6周后，常规检测血、尿生化指标、血浆和肾组织局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）及肾小球滤过率（GFR）的改变。并观察大鼠在2％体重生理盐水扩容后的利钠反应、血浆ANP浓度、尿cGMP排泄量(UcGMPV)及肾内髓组织磷酸二酯酶5（PDE5）活性。采用Western blotting及实时定量聚合酶链反应（Real time-PCR）方法检测肾内髓组织PDE5蛋白及mRNA表达。 结果：与ADR组相比，ARE显著增加阿霉素肾病大鼠UNaV（0.83±0.26 vs.0.37±0.20 mol／24h，P＜0.01）。ADR组大鼠扩容后，尽管血浆ANP水平较正常大鼠明显增加，其利钠反应和UcGMPV却显著降低（P＜0.01）。ARE能部分恢复肾病大鼠扩容利钠反应，显著增加UcGMPV（P＜0.01）。ADR组大鼠肾内髓组织PDE5活性及蛋白和mRNA表达水平均较正常组显著增加（P＜0.01），而ARE能明显抑制肾内髓组织PDE5活性（6.8±0.8.vs 9.9±1.1 pmol／mg／min）(P＜0.01)及蛋白（1.01±0.09.vs.1.38±0.14，P＜0.01）和mRNA（1.25±0.12.vs.2.05±0.16，P＜0.01）表达。ARE对肾病大鼠GFR、平均动脉血压（MAP）、血浆和肾组织局部RAAS均无明显影响（P＞0.05）。 结论：ARE能显著改善阿霉素肾病大鼠ANP抵抗，从而排钠利尿，其机制可能与ARE抑制ANP-cGMP信号通路的下游关键酶PDE5活性，尤其是抑制PDE5蛋白及mRNA表达有关。 三、黄芪水提物对mIMCD-3细胞PDE5活性及表达的影响 目的：研究黄芪水提物（ARE）对mIMCD-3细胞磷酸二酯酶5（PDE5）活性及表达的影响。 方法：体外培养条件性永生的小鼠mIMCD-3细胞，用10-7M浓度ANP刺激cGMP产生，加入500、1000、2000μg／ml的ARE进行干预，并设立空白对照组（Control）和PDE5抑制剂（Sildenafil），阳性对照组，培养12h。观察ARE对mIMCD-3细胞cGMP产生量、PDE5活性及蛋白和mRNA表达水平的影响。 结果：ARE和Sildenafil均能抑制mIMCD-3细胞PDE5活性，促进cGMP产生（P＜0.05），Sildenafil作用更明显。500、1000、2000μg／ml的ARE均显著抑制mIMCD-3细胞PDE5活性，促进cGMP产生，呈量效关系（P＜0.05）。500、1000、2000μg／ml的ARE使mIMCD-3细胞PDE5蛋白和mRNA表达水平分别降低25％、40％、55％和30％、50％、60％（P＜0.05），呈量效关系，而Sildenafil对此无明显影响（P＞0.05）。 结论：ARE能显著增加体外培养的mIMCD-3细胞ANP敏感性，提高cGMP产生量，ARE对ANP-cGMP信号通路的下游关键酶PDE5具有一定调控作用，尤其是抑制PDE5蛋白和mRNA表达是其作用的机制之一。 第二部分黄芪水提物对肾小球足细胞损伤的保护作用及分子机制 一、黄芪水提物对阿霉素肾病大鼠足细胞损伤的保护作用 目的：探讨黄芪水提物对阿霉素肾病大鼠足细胞损伤的保护作用及机制。 方法：一次性尾静脉注射阿霉素6mg／kg建立阿霉素肾病模型，将大鼠随机分为正常对照组（Norm）、阿霉素肾病模型组（ADR）、ADR+黄芪水提物组(2.5g·kg-1·d-1)（ARE）及ADR+苯那普利组(10mg·kg-1·d-1)（ACEI），每组12只。用药10周后，用双缩脲法测定24h尿蛋白定量，并行肾组织病理学检查。用WT1免疫组化染色进行足细胞计数，并计算单位肾小球面积上的足细胞数。采用免疫组化及Western blotting方法检测肾皮质α-dystroglycan、α3 integrin蛋白表达，用Real time-PCR方法检测其mRNA表达。 结果：ADR组大鼠出现大量蛋白尿（155.5±18.4 mg／d），ARE组（89.4±4.9）及ACEI组（70.9±11.8mg／d）尿蛋白均较ADR组明显降低（P＜0.01）。ADR组足细胞数目较正常组明显减少（881±80 vs.1547±109／mm2，P＜0.01），ARE组（155.5±18.4／mm2）和ACEI组（1164±97／mm2）足细胞数目较ADR组显著增加（P＜0.05），且足细胞数目与24h尿蛋白定量呈负相关（r=-0.57，P＜0.01）。免疫组化及Western blotting示ADR组大鼠肾皮质α-dystroglycan、α3 integrin蛋白表达均较正常组明显减少（P＜0.05），Real-Time PCR示ADR组大鼠肾皮质α3 integrin、α-dystroglycan mRNA表达也较正常组明显下调（P＜0.05）。而ARE组肾皮质α3 integrin、α-dystroglycan蛋白及mRNA表达均较ADR组显著增加（P＜0.05），且α3 integrin、α-dystroglycan蛋白表达量与足细胞数目正相关（r=0.50、0.43；P＜0.01），而与24小时尿蛋白定量负相关（r=-0.81、-0.87；P＜0.01）。 结论：黄芪水提物（ARE）能保护阿霉素肾病大鼠足细胞损伤，减轻蛋白尿，其机制可能与ARE上调足突-基底膜粘附分子α-dystroglycan及α3 integrin表达，缓解足细胞剥离和脱落有关。 二、黄芪水提物对体外培养的足细胞损伤的保护作用及机制 目的：研究黄芪水提物（ARE）对体外培养的足细胞损伤的保护作用及机制 方法：体外培养条件性永生的小鼠足细胞，分为（1）对照组（Control）：加入PBS；（2）阿霉素刺激组（ADR）：加入50μg／ml ADR；（3）ADR+黄芪水提物干预组（ARE）：加入500，1000，2000μg／ml浓度的ARE干预。用显微镜下直接计数法和荧光定量试剂盒方法测定足细胞粘附功能，用每孔离心后的细胞数与离心前的细胞数比例（％）以及每孔细胞的荧光强度值反映足细胞粘附能力，Western blotting和Real-Time PCR检测足细胞α-dystroglycan、α3 integrin蛋白和mRNA表达。 结果：显微镜下直接计数法显示ADR刺激组离心后的足细胞数／离心前足细胞数比值较Control组减少，而2000μg／ml的ARE干预6h和12h，则离心后的足细胞数目／离心前足细胞数目的比值均较ADR组显著增加（6h∶72±6.9％.vs.45±2.8％；12h∶65±5.9％.vs.40±2.1％，P＜0.05），荧光定量法也显示ADR刺激组粘附在基底膜蛋白复合物（BMC）上的足细胞数较Control组显著减少（P＜0.05），而2000μg／mlARE干预6h后，粘附在BMC上的足细胞数较ADR组增加70％（P＜0.05）。此外，ADR组足细胞α-dystroglycan、α3 integrin蛋白及mRNA表达水平分别较Control组平均下降60％、50％及70％、75％（P＜0.05），而2000μg／mlARE干预6h后足细胞α-dystroglycan、α3 integrin蛋白和mRNA表达量分别较ADR组平均增加50％、60％和60％、200％（P＜0.05）。 结论：黄芪水提物（ARE）对体外培养的阿霉素刺激下的足细胞损伤有明显保护作用，其机制可能与ARE上调粘附分子α-dystroglycan、α3 integrin蛋白及mRNA表达，改善足细胞与基底膜之间粘附功能有关。 综合以上两大部分内容，得出以下结论： 1．黄芪水提物（ARE）能显著促进健康人及阿霉素肾病大鼠肾脏水钠排泄，其机制与ARE影响ANP-cGMP-PDE5信号通路有关； 2．ARE对阿霉素肾病大鼠足细胞以及体外培养的足细胞损伤均有明确的保护作用，其机制与ARE上调足细胞与基底膜之间的粘附分子α-dystroglycan、α3 integrin表达，从而减缓足细胞剥离和脱落有关。