第一部分化瘀解毒中药对梗阻性肾病大鼠肾脏炎性细胞浸润和炎性因子表达的影响目的:观察梗阻性肾病模型大鼠一般情况、肾脏病理改变、梗阻侧肾脏炎性细胞浸润等,同时观察血液及梗阻侧肾脏白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素18（IL-18）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）及单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）等炎性因子变化,探索化瘀解毒中药对梗阻性肾病大鼠肾脏炎性细胞浸润及炎性因子表达的影响,为化瘀解毒中药拮抗炎性损伤提供实验依据。方法:1动物分组和模型制备:40只SD雄性大鼠以随机数字表法随机分为假手术（Sham）组、模型（UUO）组、依普利酮（EPL）组及中药（TCM）组,每组10只。采用单侧输尿管结扎手术复制梗阻性肾病大鼠模型。假手术组仅游离而不结扎输尿管。2药物干预:术后经口给药,EPL组大鼠给予依普利酮100mg/（kg·d）;TCM组给予化瘀解毒中药煎剂13.7g/（kg·d）;Sham组及UUO组给予等容量生理盐水。每天1次,连续10天。干预结束后断头取血,摘取左侧肾脏,部分组织多聚甲醛固定,其余组织-70℃保存。3检测指标与方法:观察大鼠一般状况;记录饮水量及进食量;测量24h尿量;称取体质量、梗阻侧肾质量,并计算肾脏指数（KI）;全自动生化分析仪检测血清肌酐（SCr）、尿肌酐（UCr）、血清尿素（SUr）,并计算肌酐清除率（Ccr）;HE染色观察肾组织炎性细胞浸润;SABC法检测肾脏巨噬细胞F4/80的表达;放射免疫法检测血清IL-1β、IL-18、TNF-α含量;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清MCP-1含量;Real time-PCR检测肾脏IL-1β、TNF-α、MCP-1表达;SABC法和Western blot检测IL-1β蛋白表达。4统计学处理:采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。数据采用（x±S）表示,多组比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1各组大鼠一般情况、体质量、肾质量及KI比较:Sham组进食量、饮水量稳定,体质量增长稳定,反应敏捷。各造模组大鼠进食量、饮水量均有所下降,体质量增长缓慢,反应能力减弱。UUO术后10天,与Sham组相比,UUO组大鼠体质量下降（P<0.05）、梗阻侧肾脏增大,肾质量明显增加（P<0.01）、梗阻侧KI亦明显上升（P<0.01）;与UUO组相比,EPL组及TCM组大鼠的梗阻侧肾质量明显下降（P<0.05）、体质量有所增加、梗阻侧KI亦有下降趋势,但无统计学意义（P>0.05）。2各组大鼠肾功能比较:与Sham组相比,UUO组SCr、SUr未见明显升高,Ccr未见明显降低（P>0.05）;与UUO组相比,EPL组及TCM组各指标未见明显变化（P>0.05）。3各组大鼠肾间质炎性细胞浸润情况比较:HE染色显示,Sham组大鼠肾脏结构基本正常,肾间质偶见炎性细胞浸润;UUO组大鼠输尿管扩张,肾间质炎性细胞浸润明显增多,肾小管上皮细胞变性、浊肿甚至坏死;EPL组及TCM组大鼠输尿管扩张、肾小管上皮细胞亦有变性与浊肿,但炎性细胞浸润明显减轻。4各组大鼠肾组织F4/80表达比较:Sham组大鼠肾间质仅见少量F4/80阳性细胞;UUO组F4/80阳性细胞浸润明显增多,主要表达于髓质;EPL及中药组可见到阳性细胞,但较UUO组明显减少。5各组大鼠血清IL-1β、IL-18、TNF-α及MCP-1含量比较:与Sham组大鼠比较,UUO组血清IL-1β、IL-18、TNF-α、MCP-1含量明显升高（P<0.01）;与UUO组大鼠比较,EPL组血清IL-1β、TNF-α、MCP-1含量明显降低（P<0.01）、IL-18亦有下降趋势（P>0.05）;与UUO组大鼠比较,TCM组血清IL-1β、TNF-α含量明显降低（P<0.01）,MCP-1含量降低（P<0.05）,IL-18含量亦有下降趋势（P>0.05）。6各组大鼠肾脏IL-1β、TNF-α、MCP-1 m RNA表达比较:与Sham组大鼠比较,UUO组肾组织IL-1β、TNF-α、MCP-1表达明显升高（P<0.01）;与UUO组大鼠比较,EPL组和TCM组肾组织IL-1β、TNF-α、MCP-1表达明显降低（P<0.01）。7 SABC法检测各组大鼠肾脏IL-1β蛋白表达比较:Sham组肾组织IL-1β呈弱表达,UUO组IL-1β主要表达于肾小管上皮细胞胞浆。与Sham组大鼠比较,UUO组肾组织IL-1β表达明显增强;与UUO组大鼠比较,EPL组和TCM组肾组织IL-1β表达明显减弱。8 Western Blot法检测各组大鼠肾脏IL-1β蛋白表达比较:UUO组大鼠肾组织IL-1β表达明显高于Sham组（P<0.01）;与UUO组大鼠比较,EPL组和TCM组肾组织IL-1β表达明显降低（P<0.01）。第二部分化瘀解毒中药对梗阻性肾病大鼠肾脏细胞焦亡（Pyroptosis）及NLRP3炎症小体信号通路的影响目的:观察梗阻性肾病模型大鼠肾脏NLRP3介导的细胞焦亡改变;观察化瘀解毒中药对梗阻性肾病时NLRP3-Caspase-1-IL-1β轴以及NLRP3-Caspase-1-Pyroptosis通路的影响;同时探讨梗阻性肾病NF-κB与NLRP3信号通路的关系以及化瘀解毒中药的影响;从而明确化瘀解毒中药拮抗炎性损伤的分子机制,并寻找其作用靶点。方法:1动物分组、模型制备及药物干预方法同第一部分。2检测指标与方法:TUNEL染色检测肾脏组织细胞DNA损伤情况;HE染色观察肾脏损伤细胞的形态;Real time-PCR检测肾脏NLRP3、Caspase-1、IL-1β及NF-κB m RNA表达;SABC法检测肾脏NLRP3、Caspase-1及IL-1β蛋白表达并定位;Western blot法检测肾脏NLRP3、Caspase-1、IL-1β及NF-κB蛋白表达并定量。3统计学处理同第一部分。结果:1各组大鼠肾脏组织细胞TUNEL染色阳性率比较:Sham组仅见少量TUNEL阳性细胞。与Sham组比较,UUO组细胞阳性率升高,以髓质扩张的远端小管上皮细胞为主（P<0.01）。与UUO组比较,EPL组和TCM组的远端小管TUNEL阳性细胞减少,阳性率降低（P<0.05,P<0.01）。2 UUO诱导的肾脏细胞损伤表现为多种病理形态:胞核固缩或断裂,胞膜无明显变化,为凋亡（Apoptosis）细胞形态特征;胞核固缩或断裂,胞浆肿胀,胞膜不完整,为焦亡（Pyroptosis）细胞形态特征;胞核肿胀或溶解,胞浆肿胀,胞膜不完整,为坏死（Necrosis）细胞形态特征。3各组大鼠肾脏NLRP3、Caspase-1 m RNA表达比较:与Sham组比较,UUO组肾脏NLRP3、Caspase-1表达升高（P<0.01）。与UUO组比较,EPL组及TCM组NLRP3、Caspase-1表达降低（P<0.01）。4 SABC法检测UUO大鼠肾脏NLRP3、Caspase-1分子蛋白表达:Sham组NLRP3表达不明显,UUO组表达显著增强,主要表达于肾间质巨噬细胞及肾小管上皮细胞,EPL组及TCM组表达较UUO组显著减弱。Sham组Caspase-1呈弱表达,UUO组表达明显增强,主要见于肾小管上皮细胞胞浆,EPL组及TCM组较UUO组显著减弱。5 Western blot检测UUO大鼠肾脏NLRP3、Caspase-1分子蛋白表达:Sham组NLRP3、Caspase-1分子均呈弱表达,UUO组表达明显增强（P<0.01）,EPL组及TCM组表达较UUO组明显减弱（P<0.01）。6各组大鼠肾脏IL-1β分子m RNA及蛋白表达:见第一部分。7各组大鼠肾脏NF-κB m RNA及蛋白表达:与Sham组比较,UUO组肾脏NF-κB m RNA表达升高（P<0.01）。与UUO组比较,EPL组及TCM组NF-κB m RNA表达降低（P<0.01）。Western blot结果显示,Sham组大鼠肾脏NF-κB（p65）呈弱表达,UUO组表达明显增强（P<0.01）,EPL组及TCM组表达较UUO组明显减弱（P<0.01）。第三部分化瘀解毒中药含药血清对m DCT细胞焦亡（Pyroptosis）及NLRP3炎症小体信号通路的影响目的:观察醛固酮诱导的m DCT细胞NLRP3、Caspase-1、IL-1β及NF-κB的表达情况,同时观察m DCT细胞DNA损伤及膜损伤情况;以探索化瘀解毒中药对m DCT细胞NF-κB-NLRP3-Caspase-1-IL-1β信号转导通路及细胞焦亡的影响;从而进一步明确化瘀解毒中药拮抗炎性损伤的分子机制及其作用靶点。方法:1含药血清制备:10只SD大鼠以随机数字表法随机分为对照组与中药组,每组5只。中药组给予化瘀解毒中药煎剂13.7g/（kg·d）;对照组给予等容量生理盐水。每天1次,连续10天。末次给药1h后腹主动脉采血,分离血清。2细胞培养:肾小管上皮细胞m DCT培养在DMEM培养液（含10%20%胎牛血清,青霉素和链霉素各100单位/ml）中,置于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中,隔日换液,待细胞进入对数生长期后,制成单细胞悬液（4×104个/ml）,接种于6孔板培养或分瓶培养24小时,换成无血清DMEM培养液继续培养24小时,使细胞同步化,而后加药刺激24小时,收集细胞或上清液。3细胞分组:培养细胞分为五组:对照（Cont）组、醛固酮（ALD）组、依普利酮加醛固酮（EPL+ALD）组、正常血清加醛固酮（NS+ALD）组和含药血清加醛固酮（DS+ALD）组。Cont组加入无药培养液;其他各组均加入含1μM（终浓度）醛固酮的培养液;EPL+ALD组加入10μM（终浓度）的依普利酮作用30分钟后再加入醛固酮培养液;NS+ALD组加入10%（终浓度）正常血清;DS+ALD组加入10%（终浓度）含药血清。Western blot实验细胞分为四组:对照（Cont）组、醛固酮（ALD）组、依普利酮（EPL）组、中药（TCM）组。Cont组加入无药培养液;其他各组均加入含1μM（终浓度）醛固酮的培养液;EPL组加入10μM（终浓度）的依普利酮作用30分钟后再加入醛固酮培养液;TCM组加入10%（终浓度）含药血清;Cont、ALD及EPL组均加入10%（终浓度）正常血清。4检测指标与方法:采用免疫荧光染色/激光共聚焦显微系统检测醛固酮诱导的m DCT细胞NLRP3、Caspase-1及IL-1β表达情况;乳酸脱氢酶（LDH）实验检测m DCT细胞的膜损伤情况;TUNEL染色检测m DCT细胞的DNA损伤情况;Western blot检测m DCT细胞NLRP3、Caspase1、IL-1β及NF-κB（p65）的表达。5统计学处理同第一部分。结果:1免疫荧光染色/激光共聚焦显微系统检测m DCT细胞NLRP3、Caspase-1及IL-1β表达:DAPI使m DCT细胞细胞核呈蓝色荧光,NLRP3、Caspase-1及IL-1β分子主要表达于细胞浆,呈橘红荧光。结果证实经醛固酮刺激后,细胞可见NLRP3、Caspase-1及IL-1β表达。2各组m DCT细胞培养上清液LDH含量比较:ALD组m DCT细胞培养上清液中LDH含量明显高于Cont组（P<0.01）;与ALD组比较,EPL+ALD组LDH含量明显降低（P<0.01）;DS+ALD组LDH含量低于NS+ALD组,但无统计学意义。3各组m DCT细胞TUNEL染色阳性率比较:ALD组m DCT细胞TUNEL阳性细胞增多,高于Cont组（P<0.01）;与ALD组比较,EPL+ALD组TUNEL阳性率降低（P<0.05）;与NS+ALD组比较,DS+ALD组TUNEL阳性率降低（P<0.05）。4各组m DCT细胞NLRP3、Caspase-1及IL-1β表达:与Cont组比较,ALD组细胞NLRP3、Caspase-1及IL-1β表达明显增强（P<0.01）;与ALD组比较,EPL组及TCM组表达明显减弱（P<0.01）。5各组m DCT细胞NF-κB（p65）表达:Cont组细胞NF-κB分子均呈弱表达,ALD组表达明显增强（P<0.01）,EPL组及TCM组表达较ALD组减弱（P<0.05）。结论:1炎性损伤在梗阻性肾病进展中发挥着重要作用,IL-1β、IL-18、TNF-α、MCP-1等炎性因子参与这一过程。2细胞焦亡（Pyroptosis）是梗阻性肾病的重要病理改变,与NLRP3活化相关,通过NLRP3-Caspase-1-IL-1β/Pyroptosis通路诱导细胞损伤。3化瘀解毒中药减轻梗阻性肾病炎性损伤的机制与其下调NLRP3表达而抑制炎性因子分泌、并抑制Caspase-1介导的细胞焦亡相关。4炎性细胞浸润、炎性因子增多分别是肾病“浊毒”形成的细胞学基础、分子基础之一;NF-κB-NLRP3-Caspase-1信号转导通路是肾病“浊毒”形成的分子机制之一。NLRP3可能是化瘀解毒中药拮抗炎性损伤的靶点之一。
