川楝子毒性及配伍减毒的代谢组学研究

川楝子（Melia toosendan Sieb）为楝科楝属植物川楝的干燥成熟果实,具有疏肝理气,行气止痛之功效,常用于胸胁、脘腹胀痛、疝痛、虫积腹痛等症。广泛应用于临床疾病的治疗。川楝子主要成分川楝素是迄今发现的唯一抗肉毒毒素的天然化合物,且对多种肿瘤细胞具有抑制生长、诱导凋亡作用。有研究表明,大鼠或小鼠口服大剂量的川楝子后可致肝损伤,然而,现在仅在细胞水平上的肝细胞损伤机制进行研究。关于如何在服用川楝子的过程中动态监测如对肝肾毒性的变化,解释川楝子在体内毒性代谢机制方面还未有研究报道,影响其在临床上的应用。本研究利用基于核磁共振的代谢组学方法对川楝子水提物、不同极性提取物、以及与白芍配伍的毒性进行了研究,探讨了其毒性机制,并结合中医配伍减毒理论,对白芍与川楝子配伍应用可减毒的代谢机制进行了代谢组学研究。 1.在本研究中,利用基于NMR的代谢组学方法对机体尿液、血清进行~1H-NMR测定,为了解决水峰信号干扰其他小分子物质信号的问题,在试验中采用MPFGE脉冲序列抑制水峰。对空白大鼠尿液~1H-NMR谱峰指认中,发现TCA中间产物如柠檬酸,2-OG,琥珀酸等信号明显,而在给药后,氢谱谱峰信号发生变化,将不同组别~1H-NMR积分数据进行主成分分析找出引起组间差异的一系列小分子代谢物,从变化的代谢物组群上对生命现象作出解释。 2.单次口服给予SD大鼠川楝子水提物（200g/kg）,对大鼠血清生化指标进行检测、统计分析,观察肝脏、肾脏组织形态变化,利用1H-NMR连续监测尿样中代谢物的变化,并对谱图数据进行主成分分析。结果显示:给药24h后以主成分分析方法从一组候选代谢物中找出与川楝子造成大鼠肝、肾毒性相关的生物标记物,如柠檬酸、琥珀酸、2-OG和牛磺酸水平下降,肌酐、TMAO、乳酸、马尿酸、甜菜碱、甘氨酸水平升高,结合病理生化指标,以及文献中的研究结果,从代谢物的角度来推测川楝子的毒性作用过程的机制。 3.该部分利用代谢组学从代谢物水平对川楝子毒性的时效、量效关系进行了研究。发现随着给药剂量加大,给药时间延长,机体在得分轨迹图上代谢轨迹偏离对照组越多。高剂量组在给药过程中,尿液中代谢物如柠檬酸、琥珀酸、2-OG、牛磺酸、甜菜碱、甘氨酸水平下降,乳酸、TMAO、肌酸/肌酐水平升高,说明川楝子毒性效应可能涉及到肝、肾。高剂量组在给药期间转氨酶升高,肝细胞出现变形、坏死等病变,肾小管扩张、上皮细胞变性、坏死、脱落;中剂量组转氨酶无明显变化,病理形态上可见肝窦扩张,该细胞散在轻微变性,肾小管上皮细胞变性、坏死等。低剂量组在生化指标未见异常,肝、肾组织未见病变。可见川楝子毒性具有一定的时效量效关系。 4.为进一步确定川楝子毒性作用的物质基础,利用川楝子不同极性溶剂提取物（石油醚、乙酸乙酯、正丁醇）作用于机体来进行研究,从血清1H-NMR谱峰数据分析得到的PCA得分图上可看出四组能完全分开,石油醚组离对照组最远,乙酸乙酯组最近。乙酸乙酯提取物组转氨酶升高,肝细胞广泛变性,肾小管明显扩张,上皮细胞变性,损伤甚至脱落。石油醚提取物组和正丁醇提取物组生化指标和病理形态未见异常。说明川楝子乙酸乙酯提取物对机体具有损伤作用。 5.从白芍配伍川楝子的代谢组学研究中发现,与川楝子组相比,配伍组尿液中代谢物变化相对缓和,如甲酸、葡萄糖、柠檬酸、琥珀酸、2-OG、肌酸/肌酐、乳酸、谷氨酰胺、TMAO等。从生化指标上看,配伍组转氨酶升高但与对照组相比无统计学意义,少量肝细胞、肾小管上皮细胞变性;川楝子组转氨酶明显升高,肝细胞变性,肾小管上皮细胞变性坏死。说明白芍具有一定的对抗川楝子毒性的作用。 本实验应用NMR技术对川楝子1H-NMR谱的生物标记物进行了归属,对毒性的时效量效关系进行了探讨,确定了毒性物质的主要提取部位,并证实了配伍减毒理论的科学性。研究表明,应用代谢组学方法对川楝子的毒性及配伍减毒作用进行研究具有传统生理病理分析所不具备的对机体无损、样品处理简单、可一次测定全部代谢物等优点。利用现代的科学技术来阐述中药的毒性机制,有利于中药研究的现代化发展。