烧伤后高迁移率族蛋白B1对树突状细胞免疫功能影响的实验研究

目的：1、采用严重烫伤延迟复苏动物模型，明确高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的变化及其与树突状细胞(DC)分化成熟的关系。2、通过严重烫伤延迟复苏动物模型，阐明HMGB1对DC分化成熟的受体作用机制。3、探讨严重烫伤延迟复苏后HMGB1介导的DC对T淋巴细胞免疫功能的影响及调节机制。4、观察丙酮酸乙酯(EP)对重度烫伤延迟复苏动物免疫功能及脏器损害的可能保护效应。 方法：采用重度烫伤延迟复苏动物模型。雄性清洁级Wistar大鼠，体重230～250g，浸于(99±0.5)℃沸水中12s，造成30％体表面积Ⅲ度烫伤。伤后延迟6小时抗休克复苏，在伤后6小时从腹腔给予林格液(40ml/kg)抗休克治疗，此外在烫伤后12、24、36、48小时分别给予4ml/次林格液腹腔内注射。实验分组：136只大鼠随机分为5组，(1)正常对照组(n=8)：麻醉后活杀。(2)假烫伤组(n=32)；(3)烫伤组(n=32)；(4)EP治疗组(n=32)：EP加入林格液中随补液给药(EP为28mM)；(5)晚期糖基化终末产物受体(RAGE)抗体(1mg/ml)治疗组(n=32)：烫伤后6、24小时从阴茎背静脉给予RAGE抗体(1mg/kg)治疗。以上后4组实验动物再分为4个亚组，分别于烫伤后1、3、5、7天无菌取血和脾脏。分离血清，-20℃贮存。脾脏一部分无菌、无酶液氮冻存，另一部分用于提取DC和T淋巴细胞。DC的分离纯化采用MiniMACS免疫磁性分离系统进行。利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，分离T淋巴细胞。采用流式细胞术检测细胞免疫表型和细胞表面受体，MTT法检测脾T淋巴细胞增殖，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清、细胞孵育上清及组织匀浆液的细胞因子和T淋巴细胞活化的核因子(NF)-κB。采用荧光定量PCR检测目的基因表达水平。 结果：(1)烫伤延迟复苏导致动物脾脏HMGB1基因、蛋白表达和血清 HMGB1水平在伤后1～7天显著升高，脾组织中HMGB1含量第1天达峰值，血清HMGB1水平于第3天达峰值。EP干预后烫伤动物脾脏HMGB1基因、蛋白表达和血清HMGB1水平1～7天均明显降低。RAGE抗体干预对烫伤动物脾脏和血清HMGB1无明显影响。(2)严重烫伤后1～7天脾脏DC表面CD80的表达与假烫伤组的表达比较无统计学差异，CD86的表达明显增强，MHCⅡ的表达只在伤后第1天明显增高，DC摄取葡聚糖的能力与假烫伤组比较1～7天明显减低，表明DC向成熟发展，但表型表达不完全。EP干预后烫伤动物脾脏DC表面CD80、MHCⅡ的表达1～7天均明显升高，CD86的表达仍保持较高，DC摄取葡聚糖的能力在1～7天仍较低，表明DC成熟，表型表达正常。RAGE抗体干预后烫伤动物脾脏DC表面CD80的表达在1、3天显著增强，MHCⅡ表达1～7天明显增高，CD86的表达仍较高，DC摄取葡聚糖的能力1～7天仍较低，表明DC成熟，表型表达正常。(3)严重烫伤后1～7天动物脾脏DC表面RAGE的表达明显升高。EP干预后脾脏DC表面RAGE的表达于1、5、7天显著降低，但仍明显高于假烫伤组。RAGE抗体干预后DC表面RAGE表达1～5天明显降低。(4)烫伤延迟复苏导致动物脾脏IL-12 mRNA表达1、3天显著降低，5、7天明显高于假烫伤组动物。EP或RAGE抗体干预后，烫伤动物脾脏IL-12 mRNA表达1～5天明显升高。烫伤后1～7天与假烫伤组比较，DC孵育上清中和血中IL-12的量与假烫伤组比较无统计学差异。应用EP或RAGE抗体干预均可明显提高伤后1～7天烫伤动物脾DC孵育上清中和血中IL-12的水平。(5)烫伤延迟复苏后1～7天脾T淋巴细胞对丝裂原刺激的增殖反应受抑制，IL-2 mRNA表达1、3天无改变，5、7天明显降低，分泌IL-2的量1～7天显著下降，IL-2Rα mRNA、IL-2Rα表达1～5天明显降低。EP或RAGE抗体干预能明显减轻1～7天烫伤对脾T淋巴细胞增殖的抑制，并且IL-2 mRNA表达、IL-2的分泌和IL-2Rα mRNA、IL-2Rα表达明显上升。(6)严重烫伤后动物脾T淋巴细胞经丝裂原刺激18小时后分泌IL-4的量比假烫伤组明显增加，而分泌IFN-γ的量明显降低，提示严重烫伤后，T淋巴细胞向Th2漂移。用EP或RAGE抗体干预后，烫伤动物脾T淋巴细胞分泌HL-4的量明显下降，分泌IFN-γ的量则明显增加，提示EP或RAGE抗体干预可使烫伤后T淋巴细胞向Th1漂移。(7)烫伤组与假烫伤组比较，大鼠脾脏T淋巴细胞活化的NF-κB伤后1～7天明显降低。应用EP或RAGE抗体干预均可明显提高1～7天烫伤动物脾T淋巴细胞活化的NF-κB。(8)烫伤组与假烫伤组比较，大鼠血中丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)及心肌激酶(CK-MB)伤后1～7天明显升高，血中肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)1～5天明显升高。EP或RAGE抗体干预可明显降低烫伤后动物血中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、尿素氮及心肌激酶的含量。(9)脾组织中HMGB1含量与DC表面CD86、RAGE的表达呈正相关，与DC萄聚糖摄取功能和CD80、MHCⅡ、孵育上清中IL-12、TNF-α的含量呈负相关。脾组织中HMGB1含量与脾T淋巴细胞增值、表面IL-2Rα表达、孵育上清中IL-2、IFN-γ的含量、NF-κB活性呈负相关，与血清sIL-2R含量、孵育上清中IL-4的含量呈正相关。血清HMGB1含量与血清生化指标ALT、AST、Cr、BUN及CK-MB水平均呈正相关。 结论：1．HMGB1在严重烫伤后具有升高较晚、持续时间较长的特征。HMGB1可能参与了烫伤后脓毒症所致多器官损害的发病过程。HMGB1的过度升高刺激DC向成熟发展，但表型表达异常，DC功能障碍，从而介导T淋巴细胞增殖反应低，并向Th2漂移，免疫功能抑制。2．过量的HMGB1可能主要通过受体RAGE介导DC表型表达异常、DC功能障碍。HMGB1介导的DC功能障碍可能通过下调T淋巴细胞NF-κB的活性而减少了IL-2基因表达和蛋白合成，进而影响T淋巴细胞的增殖反应和免疫功能。3．EP可能主要通过抑制HMGB1的合成释放，改善烫伤延迟复苏动物细胞免疫功能紊乱，保护动物的主要脏器。