目的：
通过研究麻杏石甘汤对A型流感病毒感染小鼠体重、肺指数、免疫器官重量指数、肺部病理变化和IL-2、IL-4、TNF-α血清中的分泌水平以及在肺组织中蛋白定位与定量表达水平的影响,初步探讨该方对流感病毒感染小鼠肺部病理损伤与免疫功能的影响,并阐明其免疫调节作用机制,为麻杏石甘汤临床应用提供理论依据。
方法：
小鼠经鼻腔接种A型流感病毒小鼠肺适应株(A/PR/8/34)建立动物感染模型。实验设正常对照组、模型对照组、利巴韦林组、抗病毒颗粒组和麻杏石甘汤(MXSGD)临床等效剂量组、2倍临床等效剂量组,经灌胃给药或给生理盐水7天后,比较各组小鼠体重、肺指数、脾指数和胸腺指数,用HE染色光镜下观察小鼠肺组织的病理变化,应用ELISA法检测小鼠血清中IL-2、IL-4、TNF-α的含量,应用免疫组织化学法定位与半定量检测小鼠肺组织中IL-2、IL-4、TNF-α的蛋白表达水平,并应用western blotting技术精确定量检测肺组织中IL-2、IL-4、TNF-α的蛋白表达水平。比较各组动物的症状反应程度和各项检测指标的变化差异及其病理意义。
结果：
1.麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠一般状况的影响
通过对流感病毒感染小鼠的一般状况(如体重、活动、食欲等)的观察,对感染前后各组小鼠的体重进行分析比较,判断麻杏石甘汤对病毒感染小鼠一般状况的影响。结果显示,在感染流感病毒48h后小鼠开始表现精神沉郁,耸毛、卷缩、毛发无光泽,活动减少,体重下降,畏寒怕冷,呼吸急促,呈明显的腹式呼吸等症状。模型对照组小鼠体重下降明显,与正常对照组比较,有显著差异(P<0.01)。MXSGD临床等效剂量组、2倍临床等效剂量组小鼠体重有所增加,与模型对照组比较,有显著差异(P<0.01)。
2.麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠肺指数、肺指数抑制率及肺组织病理变化的影响
流感病毒感染小鼠,导致肺部炎症、肺指数升高、肺组织出现明显的病理损伤,肺泡、肺泡囊、肺泡管、肺泡隔、细支气管等正常的组织结构消失,结缔组织增生,大量淋巴细胞浸润,血管内充血。与正常对照组比较,模型对照组肺指数显著升高(P<0.01)。MXSGD临床等效剂量组、2倍临床等效剂量组肺指数显著下降,肺组织病理损伤显著改善(P<0.01)；肺组织结构较为完整,偶可见少量淋巴细胞的浸润,肺泡、肺泡囊、肺饱管、肺泡隔形态完整,细胞呈红色,细胞核呈蓝色。
3.麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠胸腺指数和脾指数的影响
胸腺、脾脏是机体的免疫器官,其功能与机体的免疫应答水平免疫调节状况密切相关。结果显示：流感病毒感染小鼠胸腺指数和脾指数降低,与正常对照组比较有显著差异(P<0.01)。MXSGD临床等效剂量组、2倍临床等效剂量组能显著提高胸腺指数和脾指数(P<0.01,P<0.05)。
4.麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠IL-2、IL-4、TNF-α在血清中含量水平与肺组织中表达水平的影响
通过研究麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠对以上细胞因子血清含量水平与肺组织中蛋白表达水平的影响,初步探讨麻杏石甘汤抗流感病毒的作用机制。
4.1 ELISA法检测结果显示：流感病毒感染小鼠后,血清中IL-2含量水平降低,而IL-4、TNF-α含量水平升高,与正常对照组比较,差异显著(P<0.01,P<0.05)。MXSGD临床等效剂量组、2倍临床等效剂量组小鼠血清中IL-2含量水平升高,IL-4、TNF-α含量水平降低,差异显著(P<0.01,P<0.05)。
4.2免疫组化法定位与半定量检测结果显示：流感病毒感染小鼠后,肺组织中IL-2蛋白表达水平降低,IL-4和TNF-α蛋白表达水平升高,与正常对照组比较,差异显著(P<0.01)。MXSGD临床等效剂量组、2倍临床等效剂量组小鼠肺组织中IL-2蛋白表达水平升高,IL-4和TNF-α蛋白表达水平度降低(P<0.01,P<0.05)
4.3 Western blotting法定量检测结果显示：流感病毒感染小鼠后,肺组织中IL-2蛋白表达水平降低,IL-4、TNF-α蛋白表达水平升高,与正常对照组比较,差异显著(P<0.01)。MXSGD临床等效剂量组、2倍临床等效剂量组小鼠肺组织中IL-2蛋白表达水平均不同程度升高,IL-4、TNF-α蛋白表达水平降低,与模型对照组比较，差异显著(P<0.01)
结论：
1.麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠有保护作用：临床等效剂量、2倍临床等效剂量的麻杏石甘汤能抑制流感病毒感染所致的体重下降,并能明显改善流感症状,提示：麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠具有一定的保护作用。
2.麻杏石甘汤能抑制病毒复制,减轻肺病理损伤：临床等效剂量、2倍临床等效剂量的麻杏石甘汤能缓解流感病毒感染小鼠的肺组织炎症反应,显著降低肺指数,减轻肺组织病理损伤,使肺组织形态结构较为完整。提示：麻杏石甘汤可抑制流感病毒的复制,改善肺组织病理损伤。
3.麻杏石甘汤对流感感染小鼠免疫器官具有保护作用：临床等效剂量、2倍临床等效剂量的麻杏石甘汤能显著提高流感病毒感染小鼠的胸腺指数和脾指数,提示：麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠的免疫器官有保护作用,这也应该是该方调节免疫应答的基础。
4.麻杏石甘汤对流感感染小鼠IL-2、IL-4、TNT-α的血清含量有调节作用：临床等效剂量、2倍临床等效剂量的能促进血清中IL-2的分泌,而抑制IL-4、TNF-α的分泌。提示：麻杏石甘汤能对流感病毒感染引起的机体炎症具有一定的抑制作用,同时能提高细胞免疫应答水平,增强抗病毒能力。
5.麻杏石甘汤对流感感染小鼠的肺组织中IL-2、IL-4、TNF-α的蛋白表达具有调节作用：分析免疫组化法和Western blotting法检测肺中上述的蛋白表达结果发现,肺组织中细胞因子表达较血清显著,表明流感病毒感染小鼠后,肺部免疫功能反应更强烈。尽管血清中细胞因子表达不如肺中显著,但总的趋势基本一致,说明麻杏石甘汤不仅能调节血清中细胞因子的分泌,而且能调节肺组织中上述细胞因子的蛋白表达水平,这应该是该方缓解肺部炎症,增强机体抗病毒免疫功能的机制之一。
综上所述,麻杏石甘汤可通过保护胸腺和脾,而提高流感病毒感染小鼠的免疫功能；可通过调节细胞因子包括炎症因子的分泌而缓解流感病毒感染小鼠的肺部病理损伤。由于中药复方成分复杂,作用靶点繁多,细胞因子在体内相互促进又相互制约,形成复杂的细胞因子调节网络。因此,麻杏石甘汤防治流感病毒感染深层次的免疫学机理的研究还有待进一步开展。
