目的:
观察大黄素对脂肪变性L02肝细胞UCP2 mRNA表达的影响,探讨其对脂变肝细胞的降脂作用和机制。
方法:
1.复制模型:以L02肝细胞为研究对象,用含50%小牛血清的1640培养基孵育L02肝细胞48h,建立肝细胞脂肪变性模型,用油红O染色,倒置显微镜观察肝细胞的脂滴积聚情况,检测细胞培养上清肝酶(ALT、AST、ALP、LDH)和细胞内甘油三酯(TG)的变化。
2.筛选药物浓度:采用MTT法测定大黄素作用于脂肪变性肝细胞的适宜浓度。
3.指标检测:模型复制成功后,分为4组:模型组、自然恢复组、大黄素高剂量组、大黄素低剂量组,同时设立正常对照组。药物作用24h、48h后,分别采用全自动生化分析仪检测肝细胞内TG含量的变化。采用RT-PCR法检测各组孵育24h后肝细胞內UCP2 mRNA的表达。
结果:
1.肝细胞脂肪变性模型:成功建立了高浓度小牛血清诱导的L02肝细胞脂肪变性模型,油红O染色显示,模型组在培养24h、48h、72h后,细胞内有逐渐增多的橘红色和红色的脂滴出现,而正常组细胞内则少见。与正常组比较,造模24h后细胞上清AST、LDH含量显著升高(P＜0.01),ALT、ALP未见有显著变化(P＞0.05),肝细胞中TG含量明显升高(P＜0.01);在48h、72h时段,则ALT、AST、ALP、LDH和TG水平都显著升高(P＜0.5,或P＜0.01)。
2.肝脂:大黄素治疗24h后,自然恢复组肝细胞內TG含量与模型组比较明显降低(P＜0.01);与自然恢复组比较,大黄素10μM组肝细胞内TG含量明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05),而5μM组无明显降低(P＞0.05)。油红O染色结果显示,模型组细胞浆内见大量橘红色和红色的脂滴,正常组、自然恢复组和大黄素治疗组细胞浆内脂滴数和脂滴的颜色较模型组明显减少,其中大黄素10μM组减少最明显。大黄素治疗48h后,自然恢复组和各治疗组之间无显著性差异(P＞0.05)。油红O染色结果显示,模型组细胞浆内见大量橘红色和红色的脂滴,正常组、自然恢复组和大黄素治疗组细胞浆内脂滴数和脂滴的颜色较模型组明显减少。但大黄素各治疗组与自然恢复组之间比较镜下观察无明显差异。
3.肝细胞UCP2 mRNA的表达:大黄素治疗24t3后,与正常组比较,模型组肝细胞UCP2mRNA表达明显上升,差异有显著性(P＜0.01);各治疗组与自然恢复组比较,UCP2 mRNA表达无明显下降(P＞0.05)。
结论:
1.高浓度小牛血清可诱导肝细胞的脂肪变性:控制高脂因素对肝细胞的脂肪变性程度有改善作用。
2.大黄素可降低脂肪变性肝细胞的TG水平。
3.脂质在肝细胞内的蓄积可能与细胞内UCP2 mRNA表达上调有关。大黄素降低TG的作用可能与脂质代谢其他相关基因的调控有关。
