纳他霉素高产菌株选育、发酵条件优化、发酵动力学及溶解度的研究

纳他霉素（Natamycin）是一种二十六元多烯大环内酯类抗生素,由纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis）、恰塔努加链霉菌（Streptomyces chatanoogensis）和褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus）等经发酵生产,是一种高效、广谱的抗真菌抗生素。由于纳他霉素对哺乳动物细胞的毒性极低,现已在食品、医疗等领域得到广泛应用。目前纳他霉素发酵的水平较低,导致成本高、应用前景受到限制。因此,对纳他霉素发酵进行深入的研究和开发具有重要意义。本文围绕如何提高抗真菌抗生素纳他霉素的产量和质量,对生产菌种的选育、发酵工艺、目标产物的溶解度、产品提取纯化等方面进行系统研究,获得了如下结果: 建立了测定S.gilvosporeus发酵液中纳他霉素含量的反相高效液相色谱法。该方法具有操作简单、快速灵敏、准确性好等优点,可作为纳他霉素的定量研究方法。 以褐黄孢链霉菌SG 1-4为出发菌株,经硫酸二乙酯和紫外线诱变处理,并选用2-脱氧-D-葡萄糖、乙酸钠、丙酸钠、硫酸链霉素作为抗性筛选剂,最终选育出一株高产纳他霉素的突变株SG 9-16,该菌株在未优化条件下的纳他霉素产量达到0.79 g/L,比出发菌株提高了150%。经验证,菌株SG 9-16的遗传性能十分稳定。 研究了菌株SG 9-16的摇瓶分批发酵条件。确定了最佳种子培养基组成及培养条件,并设计了较好的发酵培养基。考察了种龄、接种量、溶氧、发酵培养基初始pH、温度及前体对褐黄孢链霉菌发酵合成纳他霉素的影响,对发酵培养条件进行了优化。在最适发酵条件下,菌株SG 9-16摇瓶分批发酵生产纳他霉素的产量可达到3.0 g/L,比初始条件（0.79 g/L）的提高了280%。 利用5 L发酵罐进行纳他霉素的发酵放大研究,在优化条件下,发酵罐中的纳他霉素产量可达到2.86 g/L,比摇瓶分批发酵（不添加前体）提高了170.7%。以5 L发酵罐分批发酵的实验验数据为依据,对纳他霉素分批发酵动力学进行了研究,建立了形态-结构模型,该模型能较好地反映纳他霉素的分批发酵过程。同时,以模糊理论为基础计算得到褐黄孢链霉菌发酵生产纳他霉素过程的生长-生产耦合度为18.3%,是典型的生长-生产分离过程。 根据摇瓶分批发酵的初步研究结果,采用多元线性回归技术优化褐黄孢链霉菌发酵生产纳他霉素的过程。首先通过Plackett-Burman实验挑选出影响纳他霉素产量的关键因子为:初始pH、发酵温度、KH2PO4、CaCO3、酵母抽提物、蛋白胨和种龄,进而通过最陡爬坡路径逼近最大响应区域,再利用中心旋转组合实验拟合得到了响应曲面函数。由于该函数的驻点是鞍点,因此不具有全局的最大、最小值。最后通过约束优化得到较佳的实验点。 从已知的代谢途径着手,研究进一步提高纳他霉素产量的优化策略。结果表明,向发酵培养基中添加可降低细胞能荷水平的氰化物能有效提高发酵水平:向发酵培养基中加入能捕捉铵离子的磷酸镁有利于纳他霉素合成。优化后的发酵工艺条件为:发酵培养基:葡萄糖40 g/L;牛肉膏10 g/L,MgSO4·7H2O 1.0 g/L,NaCl 2g/L,黄豆饼粉15 g/L,淀粉30 g/L,KH2PO4 O g/L,CaCO3 2.4 g/L,酵母抽提物0.34 g/L,蛋白胨6.34 g/L,K4Fe