肝郁脾虚证模型小鼠下丘脑Apdin/APJ受体的变化及逍遥散的调节作用

研究目的本课题旨在观察Apelin及其受体APJ在肝郁脾虚证模型小鼠下丘脑的表达情况及逍遥散的调节作用。对APJ/Apelin系统作用机理进行研究,探索APJ/Apelin系统与应激的关系,为肝郁脾虚证候生物学基础的研究提供新的思路。Apelin及其受体APJ参与了神经、内分泌、免疫、消化、循环等多系统的生理活动,同时在心血管、中枢神经系统、体液平衡、胃肠功能、摄食与饮水等多种生物功能中有一定的调节作用,其作为神经肽在下丘脑的室旁核与视上核表达丰富,参与下丘脑的各项生理活动。本课题通过复制C57BL/6J小鼠肝郁脾虚模型,从动物行为、宏观表征、客观指标等方面对动物模型进行评价,并观察肝郁脾虚模型小鼠下丘脑内Apelin及其受体APJ的改变及逍遥散的调节作用,通过组间对比了解逍遥散与对照组药物对小鼠的防治效果。以APJ/Apelin的表达为切入点,运用组织化学和细胞分子生物学技术从组织形态、蛋白和基因表达水平来检测肝郁脾虚证小鼠下丘脑Apelin和APJ受体的表达情况及逍遥散的干预对其表达的影响,从方证相关的角度研究肝郁脾虚证候与下丘脑APJ/Apeli n系统表达的关系。研究方法在课题组前期实验基础上,选用成年C57BL/6J小鼠80只,10-12周龄,随机分为4组,每组20只,分别为：正常对照组,模型组,逍遥散组,氟西汀组。适应性喂养7天后,采用慢性束缚+饮食失节+过度疲劳的复合应激方法制作肝郁脾虚证小鼠21天模型。每种刺激方法累计使用2-3次,造模持续21天。运用荷兰Noldus公司的行为学设备(Etho Vision 3.0行为学分析系统)对模型小鼠应激、抑郁等相关表现进行观察,行为学主要包括：小鼠宏观表征,旷场实验和糖水偏好实验等,以此对动物模型进行评价。取全脑制备石蜡切片,采用免疫组织化学方法观察逍遥散对模型小鼠下丘脑组织形态的影响以及Apelin及其受体APJ的表达水平。冰上取下丘脑,Western blot检测Apelin及其受体APJ的蛋白表达,实时荧光定量PCR检测Apelin及其受体APJ基因的表达。结果成功复制了肝郁脾虚证小鼠模型,采用实时荧光定量PCR检测小鼠下丘脑Apelin/APJ mRNA水平的变化,结果显示模型组、逍遥散组和氟西汀组三组小鼠下丘脑Apelin的 mRNA相对表达量之间无明显差异,都明显低于正常组小鼠下丘脑Apelin的 mRNA相对表达量(P<0.01)。模型组小鼠下丘脑APJ受体nRNA表达明显低于正常组、逍遥散组和氟西汀组(P<0.01)。Western blot方法检测了小鼠下丘脑Apelin及APJ受体蛋白表达情况,结果显示模型组和逍遥散组小鼠下丘脑Apelin含量明显低于正常组(P<0.01),模型组小鼠下丘脑APJ受体含量低于正常组和逍遥散组(P<0.05),同时氟西汀组小鼠下丘脑Apelin和APJ受体含量都低于正常组(P<0.05)。通过免疫组织化学方法观察各组小鼠下丘脑视上核与室旁核Apelin及APJ受体蛋白的表达,结果显示在下丘脑视上核中,Apelin在正常组、逍遥散组和氟西汀组中的阳性表达细胞个数显著多于模型组(P<0.01)；在下丘脑室旁核中,Apelin在逍遥散组中的阳性表达细胞个数多于正常组、模型组和氟西汀组,且具有显著差异(P<0.01)。在下丘脑视上核中,正常组、逍遥散组和氟西汀组Apelin的平均光密度值大于模型组,且差异显著(P<0.01),同时逍遥散组与氟西汀组Apelin的平均光密度值大于正常组(P<0.05,P<0.01)；在下丘脑室旁核中,逍遥散组Apelin的平均光密度值显著大于正常组、模型组和氟西汀组(P<0.01)。在下丘脑视上核中,APJ受体在逍遥散组中的阳性表达细胞个数明显少于正常组和模型组(P<0.05),同时APJ受体在氟西汀组中的阳性表达细胞个数明显少于其余三组(P<0.01)；在下丘脑室旁核中,APJ受体在模型组中的阳性表达细胞个数多于正常组、逍遥散组和氟西汀组,差异具有统计学意义(P<0.05)。在下丘脑视上核中,逍遥散组与氟西汀组小鼠APJ受体的平均光密度值低于正常组与模型组(P<0.05),而正常组与模型组之间无明显差异；在下丘脑室旁核中,模型组小鼠APJ受体的平均光密度值大于正常组(P<0.05),同时显著大于逍遥散组与氟西汀组(P<0.01),氟西汀组小鼠APJ受体的平均光密度值小于正常组(P<0.05)。结论当肝郁脾虚证发生时,会伴随有下丘脑中Apelin/APJ系统的变化,这种变化为Apelin蛋白表达的下调和mRNA的上调及APJ受体蛋白和mRNA的表达的上调,且逍遥散对这一神经肽系统具有调节作用。对于Apelin/APJ系统在肝郁脾虚证中的一系列变化以及逍遥散对其更全面的调节机制仍有待深入研究。