丹参GGPP合酶基因的克隆及表达分析

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）是我国一种药用植物,以根及根茎入药,具有活血调经、祛癖生新、镇静安神、凉血消痈、消肿止痛等功效,被广泛应用于冠心病、脑血管病、肝炎、肝硬化、慢性肾衰竭、月经不调和心烦不眠等病症。丹参的有效成分可分为两大类:一类是水溶性酚酸类物质,包括丹酚酸、迷迭香酸、迷迭香酸甲酯和原儿茶醛等;另一类是脂溶性二萜醌类化合物,包括丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮和二氢丹参酮等。 丹参酮类物质多属于二萜醌类化合物。牻牛儿基牠牛儿基焦磷酸合酶（Geranylgeranyldiphosphate synthase,GGPPS）是高等植物二萜类物质合成的限速酶之一,调控着代谢分支点前体牠牛儿基牻牛儿基焦磷酸（Geranylgeranyl diphosphate,GGPP）向二萜类物质的合成。本研究采用简并引物和染色体步移法克隆了丹参中GGPP合酶基因（命名为:SmGGPPS）,对该基因的序列以及启动子区域的调控信息进行了生物信息学分析,应用实时定量PCR方法,对该基因在不同器官、不同环境因子影响下的表达情况进行了探讨;采用可上调SmGGPPS基因表达的因子处理丹参植株,并用HPLC技术检测了在这些因子影响下丹参二萜类物质合成的变化。本研究为进一步阐明丹参二萜类化合物（丹参酮类）的生物合成机制及其调控提供一定的资料。 主要研究结果如下: 1.利用简并性引物并结合染色体步移法从丹参DNA水平和cDNA水平克隆了丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因（SmGGPPS）。基因全长2758 bp,包含1个内含子序列;开放读码框1086 bp,编码361个氨基酸（氨基酸序列命名为:SmGGPPS）。SmGGPPS在核酸水平和编码氨基酸水平与已报道的其它植物中同源的GGPP合酶基因都有很高的一致性（达64%以上）。 2.SmGGPPS编码氨基酸含有一个转异戊烯基焦磷酸合酶（Trans-isoprenyl diphosphatesynthases）结构域,属于转异戊烯基焦磷酸合酶蛋白家族成员。具有GGPP合酶家族的两个富含天冬氨酸的特征性序列:DDXXXXD和DDXXD。生物信息学分析显示该多肽序列N端含有叶绿体转运肽片段,是亲水的叶绿体蛋白,螺旋结构是其主要高级结构单元。 3.丹参SmGGPPS基因5'端侧翼序列（1095 bp片段）,除包含启动子核心元件和组织特异性表达相关作用元件外,还有与损伤、干旱、热、GA、SA、ABA和病原菌等诱导相关的顺式作用元件。推测SmGGPPS基冈的表达可能受到光、高温、病原菌浸染、损伤、植物激素（GA、ABA和SA）、盐溶液等因子的调控。 4.基因表达分析显示,丹参SmGGPPS基因主要在叶中特异表达:黑暗、高温、病原菌、机械损伤,盐溶液（200 mM NaCl溶液）、赤霉素（50 mM GA3）、脱落酸（100 mM ABA）和水杨酸（5 mM SA）等几种因子可诱导该基因的表达上调。 5.NaCl溶液（500 mM）、高温、GA3（50 mM）和SA（10 mM）等四种因子可促进丹参中丹参酮类化合物成分的积累,其中SA（10 mM）的效应最高,约是对照组的3倍;ABA（100mM）和黑暗虽然可以诱导丹参GGPP合酶基因表达上调,但对丹参酮类化合物积累的促进效应不明显。