洛克沙胂(Roxarsone,Rox),是一种有机砷添加剂,具有促生长,抗球虫,提高饲料转化率等优点,在世界范围内被广泛用于畜禽生产。目前研究发现低浓度的洛克沙胂对血管内皮细胞具有促进作用,但其作用机制不清楚,研究报道极少。VEGF是血管内皮细胞生长及血管生成最重要的调节因子,ERK/MAPK是调节细胞增殖、分裂的重要信号通路之一。本文在洛克沙胂对大鼠内皮细胞的生长作用中,通过特异性抑制剂阻断VEGF受体(VEGFR),ERK/MAPK信号通路中Ras和MEK,研究ERK/MAPK信号通路在洛克沙胂促内皮细胞生长中的作用。在大鼠内皮细胞体外培养中,洛克沙胂分为0.1 μMRox、1.0μMRox和10μM Rox三个组,PBS作为阴性对照。1.0 μM Rox与不同的抑制剂共处理组分为1.0μMRox+anti-VEGFR (1+anti-V)、1.0 μM Rox+anti-Ras(1+anti-R)、1.0μM Rox+anti-MEK (1+anti-M)、1.0μM Rox+anti-VEGFR+anti-Ras(l+anti-V+anti-R)、1.0μM Rox+anti-VEGFR+anti-Ras+anti-MEK (1+anti-V+anti-R+anti-M);以及相应的抑制剂对照组：15μManti-VEGFR (anti-V)、10μM anti-Ras (anti-R)、10μM anti-MEK (anti-M)、anti-VEGFR +anti-Ras (anti-V+anti-R)、anti-VEGFR+anti-Ras+anti-MEK (anti-V+anti-R+anti-M).运用MTT方法检测内皮细胞活力,Elisa方法检测培养上清中VEGF的水平,Western-blot和定量RT-PCR技术检测ERK/MAPK信号通路中相关蛋白的表达及其mRNA水平。MTT法检测内皮细胞处理24 h的细胞活力显示：Rox 0.1μM组、1.0 μM组、10μM组OD值显著高于阴性对照组(P<0.01),1.0 μM Rox组作用最强。VEGFR、Ras、MEK抑制剂与1.0μM Rox共处理组的细胞活力极显著低于1.0μM Rox洛克沙胂单独处理组(P<0.01),高于信号分子单独阻断组。两种或以上抑制剂联合阻断组的细胞活力低于单独阻断组。洛克沙胂促进内皮细胞的增殖,但特异性阻断VEGFR、Ras和MEK影响洛克沙胂对内皮细胞的增殖作用。内皮细胞不同处理后,Elisa方法检测培养上清中VEGF的含量表明：0.1、1.0和10 μMRox组VEGF含量显著高于PBS组(P<0.01),1.0μM Rox组VEGF含量最高。不同信号分子抑制剂组VEGF表达水平极显著低于正常组(P<0.01)。1.0 μM Rox联合或单独抑制VEGFR、Ras、MEK信号分子,VEGF的表达水平显著低于1.0μMRox单独处理组,高于信号分子抑制对照组。洛克沙胂对内皮细胞VEGF的表达有促进作用；VEGFR, Ras和MEK特异性阻断时,影响洛克沙肿对内皮细胞VEGF的表达。Western-blot分析蛋白表达显示：与对照组相比,不同浓度Rox处理内皮细胞Ras、MEK、ERK蛋白表达水平未见统计学差异(P>0.05),但其磷酸化蛋白均显著升高(P<0.01)。与1.0μM Rox处理组相比,VEGFR、Ras抑制剂及联合Rox处理组Ras蛋白表达水平未见统计学差异,P-Ras蛋白表达水平显著降低(p<0.01)；VEGFR、Ras、MEK抑制剂联合1.0μMRox处理组,P-MEK及P-ERK蛋白表达水平极显著降低(P<0.01)。anti-R及anti-V+anti-R处理组P-MEK蛋白表达水平显著低于相应抑制剂联合1.0μM Rox处理组(P<0.05);anti-M,anti-V+anti-R,anti-V+anti-R+anti-M处理组P-ERK蛋白表达水平极显著低于相应抑制剂联合1.0μMRox处理组(P<0.01)。洛克沙胂影响ERK/MAPK通路相关信号蛋白的磷酸化,在洛克沙肿对内皮细胞的作用中存在着VEGFR-ERK/MAPK信号传导调节。定量PCR检测mRNA水平表明：1.0μM Rox处理组ras基因表达水平与正常组相比差异不显著；一种或多种抑制剂联合洛克沙胂组,ras基因表达显著低于1.0μM Rox组：且1+anti-V与anti-V差异极显著(P<0.01).1.0 μM Rox处理组mmek-1基因表达量显著高于正常组(P<0.01), mek-2基因与正常组相比差异不显著。一种或多种抑制剂联合洛克沙胂组mek-1和mek-2基因表达水平显著低于1.0μM Rox组。三种抑制剂联合阻断时,与联合洛克沙胂处理组相比mek-1基因差异极显著(p<0.01)。1+anti-R组与anti-R组比较mek-2基因差异极显著(P<0.01)。1.0μM Rox处理组erk-1基因表达量极显著高于正常组(P<0.01),erk-2基因差异不显著。一种或多种抑制剂联合洛克沙胂处理组,erk-1和erk-2基因表达量都极显著低于1.0μM Rox组(P<0.01)。在洛克沙胂促内皮细胞生长中,从mRNA水平来看,ERK/MAPK信号通路中mek-1和erk-1发挥着主要作用。综上所述,ERK/MAPK通路在洛克沙胂促内皮细胞生长中具有调节作用。
