PI3K/Akt/mTOR介导的BDNF/TrkB信号通路在沃替西汀抗抑郁作用中的研究

目的:脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)及其下游信号通路在抑郁发病机理中的作用日益受到重视。与其他抗抑郁药物(如5-HT再摄取抑制,SSRIs)相比,沃替西汀治疗重度抑郁具有起效快、疗效高,安全性和耐受性好的突出特点,且临床及动物实验研究均证实沃替西汀对BDNF有调节作用,但具体机制尚不清楚。本实验在成功建立慢性不可预知性温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)小鼠模型的基础上,探讨沃替西汀在CUMS抑郁症动物模型中是否会对BDNF及其下游PI3K/Akt/mTOR信号通路水平产生影响,这一研究将会从分子生物学的角度对沃替西汀的作用机制进行更加深入地阐述,对临床抑郁症的治疗提供可靠的理论支持。方法:1.采用慢性CUMS实验方法建立抑郁小鼠模型。2.通过测定体重,糖水偏好实验(sucrose preference test,SPT)、Y迷宫(Y-maze test,YMT)以及强迫游泳(forced swimming test,FST)实验来评价小鼠的抑郁行为,检测模型是否成功建立。运用免疫印迹法(western-blotting,WB)检测CUMS模型小鼠海马脑区BDNF、以及磷酸化的PDK1、Akt、mTOR蛋白的表达。3.实验动物分为七组:正常对照组(生理盐水)、CUMS模型组(生理盐水)、CUMS+沃替西汀组(5 mg/kg,10 mg/kg,20 mg/kg沃替西汀)、CUMS+K252a组(25μg/kg K252a)、CUMS+K252a+沃替西汀(5 mg/kg沃替西汀,25μg/kg K252a)。使用蛋白免疫印迹法(western-blotting,WB)检测小鼠海马脑区中的BDNF/TrkB及其下游信号通路磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素(PI3K/Akt/mTOR)蛋白表达变化,并采用SPT、YMT以及FST等实验方法检测动物行为学表现。结果:1.成功构建CUMS抑郁小鼠模型。通过4周的慢性不可预知性温和应激的方法构建实验模型,并采用测量体重,SPT、YMT以及FST实验对模型的有效性进行检测,对所得数据进行分析。与对照组相比,CUMS模型组体重增加率显著降低(p<0.01);在SPT中,与对照组相比,CUMS模型组小鼠糖水偏好度明显降低(p<0.05);在FST中,与对照组相比,CUMS模型组小鼠的不动时间显著升高(p<0.01);在YMT实验中,CUMS模型组小鼠在主要臂(M-臂)停留时间占三个臂停留总时间比例明显降低(p<0.01)。提示本次实验CUMS小鼠模型构建成功。2.沃替西汀对慢性不可预知性温和应激抑郁模型小鼠行为学影响。给予沃替西汀(5 mg/kg)治疗能够显著提高CUMS模型小鼠的糖水偏好度(p<0.001),显著减少CUMS模型小鼠在FST的不动时间(p<0.05)。沃替西汀治疗明显改善CUMS模型小鼠在Y-迷宫实验中的表现,即主要臂(M-臂)的探索时间占三个臂探索时间总和的百分比明显升高(p<0.05)。上述实验结果提示沃替西汀拮抗CUMS所引发的小鼠抑郁行为。3.沃替西汀对CUMS模型小鼠海马脑区BDNF以及磷酸化的TrkB、PDK1、Akt、mTOR蛋白的表达影响。Western实验结果表明慢性持续应激会造成CUMS小鼠海马脑区内BDNF,p-TrkB以及p-PDK1,p-Akt与p-mTOR的表达水平显著减少,与对照组相比差别有显著性(p<0.01);沃替西汀组小鼠海马脑区BDNF以及p-PDK1,p-Akt与p-mTOR的表达水平与模型组相比显著增加(p<0.01)。结果提示沃替西汀能够上调PI3K/Akt/mTOR信号通路水平,拮抗CUMS引发的抑郁行为。4.BDNF受体TrkB拮抗剂K252a减弱沃替西汀对CUMS模型小鼠的治疗作用作用。经K252a处理的CUMS模型小鼠BDNF/TrkB及其下游PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白表达水平减少,沃替西汀对经K252a处理的CUMS模型小鼠的海马BDNF表达水平的下降并没有改善作用。实验结果提示沃替西汀通过BDNF/TrkB通路发挥抗CUMS模型小鼠作用。结论:1.成功建立CUMS小鼠模型。该模型操作简便,重复性好,是较为理想的抑郁动物模型,为以后的实验打下基础。2.BDNF及其下游信号通路p-PDK1,p-Akt与p-mTOR的表达水平在CUMS模型小鼠海马脑区发生了显著下调。提示BDNF在抑郁症的发病机制中起到一定作用。3.沃替西汀通过BDNF/TrkB途径上调PI3K/Akt/mTOR信号通路水平,拮抗CUMS模型小鼠的抑郁行为。