慢性乙肝中医湿热中阻、肝郁脾虚、瘀血阻络证蛋白质组学初步研究

目的：利用双向电泳技术分离慢性乙型病毒性肝炎(慢性乙肝)中医湿热中阻、肝郁脾虚和瘀血阻络三证型患者外周血总蛋白,建立相应蛋白质图谱。对差异表达的蛋白质进行质谱分析和数据库搜索,比较各证型差异表达的蛋白质,初步确定在三个证型中差异表达的蛋白质。通过对差异表达蛋白质与证候关系的分析,初步探索出慢性乙肝湿热中阻、肝郁脾虚和瘀血阻络证型的蛋白质组学规律,为中医临床辨识慢性乙肝中医证候提供可供参考的客观化指标,最终为进一步探讨慢性乙肝中医证候本质提供科学依据。方法：按照《病毒性肝炎中医辨证标准》,在泸州医学院附属中医医院2008年10月-2009年5月期间慢性乙肝住院病人中收集典型的肝郁脾虚证(4例)、湿热中阻证(4例)和瘀血阻络证(3例)共11例做为观察组,以健康正常人2例为对照组。通过对双向电泳技术中的一些环节探索如血浆的提取,上样量的选择,电泳参数的设置,凝胶的浓度和染色方法的改进,在PH4-7的IPG凝胶干胶条,以约130μg的上样量,75000v.h的电泳条件下,初步建立了慢性乙肝血浆的双向电泳体系。并且得到了分辨率好的差异蛋白表达图谱。扫描凝胶成像,以ImageMaster2D软件分析肝郁脾虚组、湿热中阻组、瘀血阻络组与健康人对照组血浆表达图谱。实验组与对照组标准化总灰度值(%Vol)相差达2倍以上的蛋白斑点视为差异表达蛋白点,切取相应的差异表达蛋白质点,进行基质辅助的激光解析飞行时间质谱(MADLDI-TOF-MS)检测,结合2-DE图谱中各蛋白质点的相对等电点(pI)、相对分子量(Mw)与Swiss-prot蛋白数据库的匹配检索,鉴定出各差异表达的蛋白质。结果：(1)获得了分辨率和重复性均较好的慢性乙肝病湿热中阻组、肝郁脾虚组、瘀血阻络组及健康人对照组血浆蛋白质组表达双向电泳银染图谱。健康人平均蛋白点数为(290±17)个,CHB湿热中阻证(350±23)个,CHB肝郁脾虚证(328±14)个,CHB瘀血阻络证(489±25)个。(2)差异蛋白点质谱鉴定,共发现10种蛋白。其功能涉及免疫,脂类代谢,炎症反应等。与正常人比较,在湿热中阻证有5个蛋白表达下调,5个蛋白表达上调；在肝郁脾虚证有4个蛋白表达下调,6个蛋白表达上调；在瘀血阻络证型有4个蛋白表达下调,6个蛋白表达上调。这些蛋白点中表达上调的有血清淀粉蛋白P(SAMP)、免疫球蛋白J链(IGJ)、C反应蛋白(CRP),表达下调的有结合珠蛋白(Hp),前白蛋白,载脂蛋白C(apoC)等。结论：(1)初步建立慢性乙肝肝郁脾虚组、湿热中阻组、瘀血阻络组及健康人对照组血浆蛋白质组表达图谱。(2)慢性乙肝肝郁脾虚证组、湿热中阻证组、瘀血阻络证组和健康对照组存在多个蛋白质表达差异,表明CHB存在多蛋白表达异常。慢性乙肝不同证型间存在多个差异表达蛋白提示同病异证具有不同的物质基础(不同的蛋白质),此为中医“证”本质研究奠定了科学基础。(3)在湿热中阻证中差异表达的蛋白质主要属于急性时相蛋白和脂类代谢有关的蛋白质。其中载脂蛋白C的表达升高可能与此证型中细胞膜损害明显而改变其结合位点有关。(4)肝郁脾虚证患者代表肝脏的修复和分泌功能的蛋白较正常人有所降低,但较湿热中、阻证和瘀血阻络组下降程度轻,提示此证型患者肝脏分泌等功能较其他两证更接近正常人水平。(5)瘀血阻络证中差异表达蛋白质涉及到免疫与炎症反应等相关蛋白质。其中HPT的大幅度降低提示瘀血阻络证的出现标志慢性乙肝向肝硬化方向发展趋势。J链、SAMP与HPT与证型演变密切相关,可望成为证型演变和疗效判断的标志。