米根霉发酵产L-乳酸的代谢调控研究

L-乳酸是食品工业、医药、化工等行业的重要有机酸原料。L-乳酸通过聚合反应生成的聚L-乳酸（PLA）是一种能够生物降解的高分子材料，不仅具有良好的机械性能，可胜任其它合成塑料的用途，而且具有良好的生物可降解性，其原料又为可再生的生物资源，如小麦、玉米、甘薯等，所以被认为是新世纪最有发展前途的新型材料。可以预言，未来的发酵有机酸市场中乳酸的需求量将超过现有的柠檬酸，而跃居第一位。 米根霉（Rhizopus oryzae）是发酵生产高光学纯度的L-乳酸的主要菌株，但目前针对米根霉的研究，仍存在诱变选育盲目性大，菌株易退化，主要代谢机理不明确，发酵参数不稳定等问题。本文基于微生物的代谢控制发酵及代谢控制育种理论，以米根霉碳代谢关键酶乳酸脱氢酶（LDH）与乙醇脱氢酶（ADH）为对象，较系统地研究了LDH及ADH的分离纯化与催化特性，Mg2+和Zn2+离子及不同通气条件下的米根霉发酵调控模式，进而筛选出米根霉高产L-乳酸的突变菌株。主要结论如下： （1）确定了EDTA定钙法快速测定发酵液中乳酸含量的方法，用10％的NaOH来调节测定液的pH值，钙黄绿素作为指示剂，测定结果有较好的重复性与准确性；建立了反相C18色谱柱，准确测定发酵液中5种有机酸的HPLC法。 （2）米根霉LDH粗酶液在30～50℃条件下有较高的稳定性，最适pH 7.5，容易被Mg2+、Ca2+激活，被K+，Zn2+抑制；LDH对NADH的米氏常数Km为7.22×10-4mol／L，对丙酮酸的米氏常数Km为1.24×10-3mol／L；ADH粗酶液的最适催化温度为25℃，最适反应pH值7.5，EDTA、Mg2+和Ca2+对该酶活力的影响较小，但较大的Zn2+浓度对该酶有一定的抑制作用，该酶对乙醛的米氏常数Km为6.8966×10-4 mol／L。 （3）米根霉AS3.3461的发酵液中添加Mg2+能够提高LDH的活性，发酵液中Mg2+浓度为0.04％时对LDH活性的激活作用最强，此时乳酸的最大浓度摇瓶条件下为63.17g／L，罐发酵条件下为65.33g／L；少量Zn2+能激活ADH的活性；Zn2+浓度为0.03％时，对LDH活性有一定激活作用，此时发酵液中的乳酸浓度最大。但随着Zn2+浓度增加到0.05％时，对LDH的最大活力产生严重的抑制，乳酸产量显著降低。摇瓶发酵液中Mg2+浓度为0.04％，Zn2+为0.03％时，乳酸转化率最大，为64.24g／L；5L发酵罐条件下最大乳酸转化率Mg2+、Zn2+浓度与摇瓶相同，此时乳酸含量为66.37g／L。 （4）米根霉AS3.3461的摇瓶装液量为10％时，乳酸产量达到最大，为69.33g／L，此时LDH活力为6.14U／mL，30％装液量下的乳酸含量及LDH活力均较低；乙醇浓度随着装液量的增加而增大，30％装液量下可达17.48 g／L；摇床转速为220 r／min时，乳酸产量达到最大，为68.14g／L；采用单膜封口发酵时，乳酸浓度为67.5g／L，LDH活力为5.83U／mL，分别比双膜封口发酵提高了64.4％和49.9％；双膜封口发酵下乙醇浓度与ADH活力分别比单膜封口发酵提高了30.0％和25.5％。5L罐发酵中，30％的装液量生成的乳酸量最大，达到69.95g／L，50％装液量生成的乳酸量最小，为64.80g／L；发酵罐转速为600r／min的发酵条件乳酸产量及LDH活力均最大，分别为71.23g／L和6.79U／mL；0.7 L／（L·min）通气条件下发酵液中的乳酸浓度最大，达到71.78g／L。摇瓶发酵中，装液量20％，摇瓶转速220r／min下可得到最大乳酸转化率，此时乳酸含量为68.14g／L，LDH活力为5.97U／mL，乙醇浓度为16.28g／L，ADH活力为15.44U／mL；5L发酵罐条件下40％装液量，600r／min转速及0.7L／（L·min）通气速率，可得到最大乳酸转化率，此时乳酸含量为71.78g／L，LDH活力为6.22U／mL，乙醇浓度为14.83g／L，ADH活力为13.69U／mL。 （5）研究采用复合诱变，筛选ADH活力降低的米根霉突变菌株，确定了NTG浓度为0.1mg／mL时，诱变效果最佳；UV诱变的最佳照射时间为180s；筛选出的ADH突变菌株swsp-1-2 L-乳酸发酵浓度达到了81.0g／L，比原始菌株提高了36.3％；乙醇浓度为5.6g／L。比出发菌株降低了66.7％。 （6）以米根霉（Rhizopus oryzae）基因组DNA为模板，PCR扩增得到含有ldhL的DNA片段，序列测定获得998bp，该序列GenBank登陆号为EF152288。PCR产物T／A克隆后再双酶切，将ldhL片段连接到大肠杆菌表达载体pET17b，得到重组表达质粒pET17b-ldhL。pET17b-ldhL转化E.coli BL21（DE3），构建的工程菌再经诱导表达培养，SDS-PAGE电泳分析菌体细胞成分，结果表明克隆的ldhL基因在大肠杆菌中实现表达。 上述研究结果，为米根霉的代谢控制发酵体系建立、高产L-乳酸突变菌株的定向选育、米根霉工程菌株的构建提供理论支持，获得的高产菌株可用于实际生产应用。同时，本研究还可以为不同微生物对碳代谢的调控提供参考。