徐长卿诱导人肝癌细胞HepG-2凋亡的实验研究

1．目的 观察徐长卿体外诱导人肝癌细胞系HepG-2细胞凋亡，初步探讨徐长卿的分子作用机制，为徐长卿治疗肝癌寻找实验依据。 2．方法 采用细胞药理学方法研究徐长卿HepG-2细胞凋亡及凋亡相关调控基因等指标的影响。主要观察指标及方法如下： 2．1徐长卿对HepG-2细胞的毒性作用实验： 用0.06％胰蛋白酶将HepG-2细胞分散成单个细胞悬液，用完全培养液制成浓度为3×10～5个／ml的细胞悬液，按0.1ml／孔接种于96孔板，置37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱内培养。待细胞贴壁2d后换含药培养液0.1ml／孔，每个浓度3孔。将徐长卿水提物原液作系列倍比稀释成以下八个浓度：50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39g／L；将徐长卿醇提物原液作系列倍比稀释成以下七个浓度50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78g／L，置37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱内继续培养，并设不加药物的对照；12d后去掉上清，所余细胞用MTT法测药物对细胞毒性。 2．2徐长卿对HepG-2细胞生长曲线的影响： 取对数生长期细胞用10％胎牛血清的DMEM培养液配成细胞数为1×10～4／ml的细胞悬液，在24孔培养板中接种，每孔1ml。细胞贴壁后，加入含徐长卿水提物浓度为22g／L和11g／L和徐长卿醇提物稀浓度为11g／L和5.5g／L的维持培养基，同时设正常对照组继续培养。在培养的第1、2、3、4、5、6、7天，各取样4孔，消化细胞后加入台盼兰染液计活细胞数，并与培养时间作图。 2．3徐长卿水提物对HepG-2肝癌细胞周期的影响： 处于指数生长期的细胞，胰酶消化后制成均匀细胞悬液，台盼蓝染色计数。当活细胞率大于95％，进行实验。①将细胞悬液用完全培养基稀释至10～5／ml，接种于50cm2培养瓶中，每瓶5ml，于37℃，5％CO2、饱和湿度条件下培养24小时，然后进行处理。②药物组，培养液中加入徐长卿水提物终浓度为22g／L、11g／L，同时做正常细胞对照。作用时间为48小时，每组3瓶。DNA染色：弃去培养液，细胞用Hanks液洗2遍，0.06％胰酶消化3分钟，轻轻吹打成细胞悬液，300g离心5分钟，去上清，将细胞重悬于1ml冷乙醇中，并轻轻吹打，4℃固定，固定时间大于24小时。固定后离心，300rpm，5分钟，去上清，加入50μg／ml的RNA酶1ml，轻轻吹打，室温避光30分钟，除去细胞内RNA。然后300 rpm，5分钟再离心，去上清，加入60μg／ml的PI 1ml，轻轻吹打，室温避光30分钟。FACS检测：样品最后上机进行FACS检测。用ModFit软件分析，统计出各时相细胞的百分比。 2．4徐长卿提取物对HepG-2肝癌细胞凋亡的影响： 2．4．1 DNA梯度电泳（DNA Ladder）观察DNA降解片段： DNA提取：药物组和正常细胞组的细胞在培养48hr后，常规抽提DNA。 检测方法：运用琼脂糖凝胶电泳检测DNA Ladder。 结果判断：正常活细胞DNA显基因组条带位于加样孔附近，坏死细胞由于其DNA的不规则降解显一条连续的膜状条带，凋亡细胞的DNA则因为DNA降解为180bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段显“梯状（ladder）”条带。 2．4．2流式细胞术观察徐长卿提取物对HepG-2肝癌细胞凋亡的影响： HepG-2细胞的培养及处理：取对数生长期的细胞，0.06％胰酶消化后制成单细胞悬液0.4％台盼蓝染色，计算活细胞率为97.5％。将细胞悬液接种至50cm2培养瓶中，10～6个细胞／瓶，在37℃，5％CO2、饱和湿度条件下培养24小时后，加入含药培养基。药物组：每瓶培养液5ml中加入徐长卿水提物终浓度为22g／L、11g／L；对照组加入等量2％DMEM。加药后于24小时、48小时每个时间点各取3瓶细胞，进行检测。 凋亡细胞的检测：小心弃掉培养液，0.06％胰酶消化3分钟，轻轻吹打细胞成单细胞悬液，1000r／min离心10分钟，Binding Buffer重悬细胞至1×10～6／ml，取100ul细胞悬液至5ml FACS管中，加入5μl Annexin V-FITC，10μl F混匀，室温下避光孵育15分钟后每管加入400ul BindirBuffer，1小时内上机进行流式细胞分析。同时染对照管（主细胞）和补偿设置管，即未染色的细胞，单染Annexin V-FIT的管和单染PI的管。 FCM流式细胞术分析：采用ALTRA型流式细胞仪，488nm激发光源。先将对照管上样，通过调整参数FSC和SSC，在散射光点图（FSC／SSC）中清获显示出一个清晰、集中的细胞群体，对细胞群体进行设门（Gate），再以门中细胞进行后续荧光信号检测。将对照管（裸细胞）的荧光强度设定为非特异性本底荧光，并在此基础上确定阳性荧光表达比率。调定流式细胞仪，使荧光散入图中裸细胞集中分布在左下象限。保持FL1、FL2、FL3不变分别将单染AV-FITC的管和单染PI的管上样，调整仪器荧光补偿值，进行光谱重叠校正后即可分析样本。每个样本上获取10，000个细胞，采用CellQuest功能软件进行分析。 3．结果 3．1徐长卿对HepG-2细胞增殖的影响： 徐长卿水提物在毒性试验中测定所得，对HepG-2细胞的药物半数毒性浓度TC50为22.07g／L。徐长卿醇提物对HepG-2细胞的药物半数毒性浓度TC50为11.32g／L，实验结果如表3显示。徐长卿水提物及醇提物在浓度50g／L，细胞出现空泡、萎缩、脱落，破坏率分别达64％和57％，徐长卿水提物浓度为12.5g／L和醇提物浓度为6.25g／L时，镜下可见细胞形态大致正常。 3．2徐长卿对HepG-2细胞生长曲线的影响： 对照组细胞在0-7天时，其细胞数分别为1、1.8、3.5、6.9、11.8、20.3、31.7、42.4万／ml。徐长卿水提物浓度为22g／L和浓度为11g／L，与对照组细胞相比，明显低于正常组，说明徐长卿水提物具有抑制肝癌细胞增殖作用。而徐长卿醇提物在浓度为11g／L和浓度为5.5g／L，其细胞数与对照组细胞相比，差异不大。说明徐长卿醇提物对Hep-G2细胞没有显著抑制作用。 3．3徐长卿对HepG-2肝癌细胞周期的影响： 徐长卿水提物高剂量作用48小时后，HepG-2细胞的细胞周期发生明显变化，HepG-2细胞大部分处于G0-G1期，占细胞总数的66.22％，高于对照组的58.43％，P＜0.05；处于S期的细胞占总数的24.1％，低于对照组26.47％，P＜0.05；作用后，处于G2-M期的细胞占细胞总数的9.68％，与对照组相比明显降低，对照组为15.1％，细胞周期分析显示，说明徐长卿水提液使该细胞生长阻止于G0／G1期。而徐长卿低剂量组则与对照组相比，无显著性差异，但仍可见与大剂量相若的作用趋势。 3．4徐长卿提取物对HepG-2肝癌细胞凋亡的影响： 用DNA梯度电泳分析HepG-2细胞DNA片段降解情况，结果发现徐长卿水提物22g／L和11g／L处理HepG-2细胞的DNA出现明显排列成梯状的分子条带；流式细胞仪分析：DNA直方图上，G1峰前出现的亚二倍体峰（Sub-G1峰）即凋亡细胞所形成的凋亡峰（仰峰），徐长卿水提物大剂量作用24小时，凋亡率为5.37％，48小时为25.34％；徐长卿水提物小剂量作用24小时，凋亡率为4.01％，48小时为18.31％，空白对照组凋亡峰为3.54％，差异显著。 4．结论 4．1徐长卿水提物及醇提物对体外培养的人肝癌细胞HepG-2生长有抑制作用，且水提物较醇提物毒性小。 4．2徐长卿水提物能抑制HepG-2细胞的生长，而徐长卿醇提物对细胞增殖没有明显的抑制作用。 4．3徐长卿水提物抑制体外培养肝癌细胞的S期，使细胞进入G2-M期受阻； 4．4徐长卿水提物具有诱导人肝癌细胞系HepG-2细胞凋亡的作用。