柑橘原生质体融合及体细胞杂种核质遗传研究

原生质体融合技术能有效克服柑橘有性杂交不亲和、雌和／或雄性败育以及珠心胚干扰等问题，实现核DNA和胞质DNA重组，为柑橘遗传改良提供了一条新的途径。本研究旨在针对我国一些优良柑橘品种种子多的问题，拟采用“胞质体-原生质体”融合和非对称融合，将温州蜜柑控制雄性不育的胞质因子转入有籽品种中，以获得新的柑橘无核种质。此外，本研究对本实验室以前通过原生质体融合获得的4个组合的体细胞杂种植株进行了核质遗传分析。主要研究结果如下： 1．开展了柑橘胞质体分离的研究，建立了高效的柑橘胞质体分离体系。首先以柑橘胞质雄性不育材料-温州蜜柑国庆1号(Citrus unshiu)的胚性悬浮系为试材分离原生质体，再通过不连续的甘露醇-蔗糖梯度和超速离心方法分离胞质体；比较了不同的离心速度、离心时间、离心温度、梯度组分的体积和浓度对胞质体分离的影响，结果表明，转速为38000r／min，温度为25℃，离心20min，15％蔗糖浓度(悬浮原生质体的下层溶液)是分离胞质体最适宜的条件，可获得纯度为90％的胞质体；胞质体的平均直径为23.2μm；使用FDA染色，发现胞质体的活力在75-85％之间；采用低熔点琼脂糖包埋培养，48h后胞质体破裂死亡。 2．开展了柑橘“胞质体-原生质体”融合，获得了国庆1号(C. unshiu，cv. GuoqingNo. 1)+诺瓦橘柚(C. reticulata×C. paradisi)、国庆1号(C. unshiu，cv. Guoqing No. 1)+默科特橘橙(C. reticulata×C. sinensis)2个组合的再生愈伤组织和胚状体。前一组合得到的愈伤组织在诱导胚状体的2％甘油培养基上未见进一步生长和分化；从后一组合，挑出的44个单个小愈伤培养在2％甘油培养基上，有3个分化出胚状体。对后一组合再生的三个细胞系进行倍性和核质基因组分析，结果表明，再生的细胞系均为二倍体，核DNA来自默科特橘橙，而线粒体DNA来源于国庆1号。 3．研究了紫外线(UV)照射柑橘原生质体作为喂养层培养目标原生质体的效果，发现UV照射的原生质体作饲养层具有促进愈伤原生质体生长的作用，而对叶肉原生质体的生长无促进作用；研究了UV对柑橘原生质体DNA片段化的影响。结果表明，UV处理后的原生质体比未处理的原生质体发生较高的DNA片段化。 4．开展了UV处理供体的非对称融合研究，获得了国庆5号(C. unshiu，cv. Guoqing No. 5)+默科特橘橙(C. reticulata×C. sinensis)、国庆1号(C. unshiu，cv. Guoqing No. 1)+诺瓦橘柚(C. reticulata×C. paradise)、国庆1号(C. unshiu，cv. Guoqing No. 1)+锦橙(C. sinensis)共3个组合的再生愈伤组织和芽。其中前2个组合获得了愈伤组织，后一个组合再生了芽，采用FCM、RAPD、AFLP和CAPS对再生的四个芽系进行鉴定，结果表明，再生的芽系为二倍体、三倍体或四倍体的体