脑源性神经营养因子裂解通路和突触可塑性在大鼠抑郁发病和抗抑郁治疗中的作用研究

第一部分慢性应激和艾司西酞普兰抗抑郁治疗对大鼠抑郁样发病及情绪相关脑区中tPA-BDNF-TrkB通路的影响背景：抑郁症是人类最为常见的精神障碍,而目前临床抗抑郁治疗仍有很多缺憾,近年来“神经营养因子”和“海马神经再生”等假说备受关注。本研究基于抑郁症上述假说,将研究点着重在上述假说的核心因子-脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的裂解通路上。p11-tPA-BDNF裂解通路是胞外BDNF裂解的最重要途径,因此对该裂解通路相关因素的研究将有助于更深入了解BDNF在神经可塑、抑郁症发病和抗抑郁治疗中的作用。目的：探讨p11-tPA-BDNF裂解通路在抑郁大鼠病理生理过程和在艾司西酞普兰抗抑郁治疗中的作用,在现有研究结果的基础上,为抑郁症发生和SSRI类药物抗抑郁治疗的具体机制提供进一步的实验证据。方法：(1)选用体重为250-300g的Sprague Dawley大鼠,制作慢性温和性不可预见性应激(CUMS)模型,造模28天；(2)通过体重、糖水偏爱、强迫游泳和旷野实验等行为学检测方法筛选抑郁样大鼠纳入后续实验；(3)模型制作成功后给予SSRI类抗抑郁剂艾司西酞普兰或生理盐水进行抗抑郁治疗或对照治疗28天；(4)通过western blot和real-time PCR检测情绪相关脑区,包括扣带回1区(Cg1)、前边缘区(PrL)、杏仁核(Amy)、海马CA1、CA3、DG中,p11-tPA-BDNF裂解通路中重要因子p11、tPA、pro-BDNF、 BDNF和TrkB表达变化情况；(5)运用免疫荧光技术观察大鼠抑郁样发病和艾司西酞普兰抗抑郁治疗后海马DG区DCX+神经元数量改变；(6)使用慢病毒(LV)-siRNA技术对海马中敲减p11基因检测动物行为学改变及其对BDNF表达的影响。结果：(1)CUMS大鼠与正常对照组大鼠相比,体重显著下降(p<0.0001),糖水偏爱显著减少(p<0.0001),旷野实验中活动总路程和站立次数显著减少(p<0.0001),强迫游泳中不动时间增加(p<0.0001)；艾司西酞普兰不影响体重变化；但可明显提高CUMS大鼠的糖水偏爱(p<0.0001),增加旷野实验站立次数(p=0.0353)和总路程(p=0.0053),减少强迫游泳不动时间(p=0.0022);(2)和未受应激的大鼠相比,CUMS显著减少模型大鼠Cg1、PrL、海马CA1、CA3和DG区中pro-BDNF蛋白、BDNF蛋白和基因、tPA蛋白和基因、p11蛋白和基因、trkB蛋白、p-trkB蛋白和基因的表达水平,而CUMS显著增加应激大鼠Amy区pro-BDNF蛋白、BDNF蛋白和基因的表达水平,显著减少该区tPA、TrkB表达水平；慢性艾司西酞普兰治疗后改变或逆转应激大鼠各脑区中上述因子表达水平的失调。(3)和正常对照组相比,应激造成DG区的DCX+细胞数量显著减少,艾司西酞普兰进行抗抑郁治疗四周后,该区DCX+细胞数量显著增加；(4)海马p11基因敲减实验部分不成功,仍在探讨中。结论：大鼠重要情绪相关脑区(扣带回1区、前边缘区、杏仁核、海马CA1、CA3、DG)中p11-tPA-BDNF通路功能失调及海马神经再生紊乱可能参与大鼠抑郁样发病的病理生理过程和艾司西酞普兰的抗抑郁治疗过程。第二部分mPFC神经环路Gray's Ⅰ型突触形态可塑性在大鼠抑郁样发病和艾司西酞普兰抗抑郁治疗中的变化研究背景：尽管大量的基础和临床研究提示神经可塑性改变和抑郁症密切相关,但抑郁症的病理生理过程仍未得到详细阐释。“突触发生假说”(synaptogenic hypothesis)是抑郁症神经可塑性障碍假说的重要组成部分,该假说认为突触功能障碍和抑郁症发生有关。目的：探讨情绪环路中Gray Ⅰ型兴奋性突触形态学改变和突触重要相关蛋白的表达变化,为抑郁症“突触发生障碍”假说提供最直接的形态学证据和支持。方法：(1)选用体重为250-300g的Sprague Dawley大鼠,制作慢性温和性不可预见性应激(CUMS)模型,造模28天;(2)通过体重、糖水偏爱、强迫游泳和旷野实验等行为学检测方法筛选抑郁大鼠纳入后续实验；(3)模型制作成功后给予SSRI类抗抑郁剂艾司西酞普兰或生理盐水进行抗抑郁治疗或对照治疗28天;(4)采用透射电镜技杏调查观察各组动物(n=6)情绪相关脑区-扣带回1区(area 1 of cingulate cortex, Cg1)、前边缘区(prelimbic cortex, PrL)、杏仁核BLA、海马CA1、CA3、DG中Grey I型兴奋性突触的突触间隙宽度、突触后致密物厚度(PSD)、平均和最大PSD厚度、活性带长度和曲率变化,观察SSRI类抗抑郁剂艾司西酞普兰对正常和抑郁大鼠海马结构中突触形态可塑性的作用；(5)运用western blot技术检测突触相关蛋白PSD93、PSD95、Spinophilin、 Synaptophysin、 Synapsin I的表达变化。结果：(1)CUMS大鼠与正常对照组大鼠相比,体重显著下降(p<0.0001),糖水偏爱显著减少(p<0.0001),旷野实验中活动总路程和站立次数显著减少(p<0.0001),强迫游泳中不动时间增加(p<0.0001)；艾司西酞普兰不影响体重变化；但可明显提高CUMS大鼠的糖水偏爱(p=0.0157),增加旷野实验站立次数(p=0.0002)和总路程(p=0.0002),减少强迫游泳不动时间(p=0.0003)；(2)首次利用透射电镜技术证实和正常对照组相比,接受CUMS的大鼠Gray Ⅰ型突触：活性带长度在Cg1、CA1、DG区中显著缩短(p=0.0427,0.007,0.0448),在BLA中显著增加(p=0.029)；平均PSD厚度在CA1区中均显著减少(p=0.049),最大PSD厚度在PrL和CA1区中显著减少(p=0.0113,0.0157),而在BLA中却明显增加(p=0.036)；突触间隙宽度在Cg1区显著增加(p=0.0427)；凸型突触的比例在Cg1、CA1、CA3、DG区中均减少(p=0.0444,0.0245,0.0385,0.0343),而在BLA中却显著增加(p=0.0346)。艾司西酞普兰治疗四周后可显著改善或逆转上述改变；(3)和正常大鼠各脑区中突触相关蛋白表达变化相比,PSD93、PSD95、spinophilin、 synapsin I和synaptophysin在应激大鼠的Cgl区表达下降(p=0.0005、<0.0001、=0.0023、=0.0007和<0.0001),在PrL区PSD93、PSD95和spinophilin蛋白表达均下降(p<0.0001、<0.0001和=0.0002),杏仁核中PSD93表达下降(p=0.0142),CA1区中PSD95表达减少(p=0.0339),CA3区中5种蛋白表达下降(p=0.0033、<0.0001、=0.0009、=0.0002和=0.0035),DG区中PSD93、PSD95、synapsin I和synaptophysinp=0.0291、=0.0417、<0.0001和<0.0001)中表达均明显减少。艾司西酞普兰治疗四周后可显著改善或逆转上述改变。结论：大鼠情绪相关脑区中兴奋性突触可塑性变化、突触相关蛋白表达变化和抑郁发病有关,SSRI类剂艾司西酞普兰通过逆转抑郁大鼠情绪相关脑区中兴奋性突触形态和突触相关蛋白改变而改善突触功能障碍,发挥抗抑郁效应。