成骨分化中糖皮质激素信号通路的研究

研究背景：骨质疏松(Osteoporosis)是最常见的骨骼代谢性疾病,其特征包括正常骨密度的减少、骨质脆弱增加以及容易轻微外伤后骨折。糖皮质激素(Glucocorticoids, GCs)是一类包括天然或人工合成的类固醇激素,主要作用是抑制炎性反应和治疗自身免疫性疾病。在临床上,天然和人工合成的糖皮质激素,尤其是病人需要大量或长期激素治疗时,都可能导致患者骨量减少或骨质疏松。糖皮质激素性骨质疏松症(Glucocorticoids-induced Osteoporosis, GCOP)是20-45岁成人骨质疏松症以及医源性骨质疏松症(Iatrogenic osteoporosis)最常见的原因。虽然人工合成的糖皮质激素如强的松、地塞米松等有GCOP等严重的并发症,由于具有突出的免疫抑制和抗炎作用,所以广泛应用于治疗过敏、类风湿性关节炎,以及抑制器官移植排斥。 尽管骨吸收是GCOP的重要原因,最近的研究也表明长期糖皮质激素应用的主要后果是成骨细胞功能障碍。糖皮质激素对成骨细胞分化和骨形成的抑制作用可能与多种机制有关。骨形成蛋白-2(Bone morphogenetic protein 2, BMP-2)具有骨诱导作用。糖皮质激素通过阻滞BMP-2的作用而抑制成骨细胞分化。Wnt信号通路也是骨形成的一个重要信号通路。研究表明,糖皮质激素也通过阻滞Wnt-b.catenin信号通路抑制成骨分化。此外,糖皮质激素也能使处于成骨分化的骨髓基质细胞转向脂肪细胞分化,并且诱导产生过氧化物酶增殖体激活受体Y(Peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ).然而除上述机制外,成骨分化中糖皮质激素信号通路目前不清楚。 具有PDZ结合序列的转录共活化因子(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif,TAZ)是类似β-catenin的一种分子,通过共活化Runx2依赖的基因转录和抑制PPARγ依赖的基因转录而促使间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSCs)成骨分化。地塞米松(Dexamethasone,DEX)是一种人工合成和临床广泛使用的糖皮质激素,目前地塞米松如何影响成骨分化仍不清楚。 稳定同位素标记的氨基酸细胞培养(Stable-isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)的通过代谢将同位素质靶导入蛋白质。两种不同生物状态的细胞在正常培养基(轻同位素)和稳定同位素标记(重同位素)培养基中生长,当细胞在培养基中增值6次以上时,稳定同位素的嵌入可达到近100%。通过液相色谱串联质谱法分析(LC-MS/MS)进行定量蛋白组学检测,肽质谱显示了两种培养基下的不同SILAC波峰,两种波峰之间的高度比代表了不同蛋白量之间准确比值,所以SIALC蛋白组学是一种精确的定量蛋白组学。 材料与方法：我们从16只4周龄雌性SD大鼠中获得骨髓细胞原代培养,并通过表面抗原和多能分化能力鉴定MSCs.P1代MSCs重新以5×105/cm2的密度种植于六孔板。为诱导MSCs成骨分化,MSCs以各种不同的诱导剂诱导,并以钙盐沉积能力(茜素红染色)和ALP活性检测细胞的成骨分化能力,以RT-PCR. Real-time PCR.Western blot.免疫组化等检测MSCs诱导成骨分化时TAZ.ALP. BMP-2.Runx-2的mRNA和蛋白质表达情况。我们还将高浓度的地塞米松作用于成骨前体MC3T3-E1细胞,观察地塞米松对MC3T3-E1细胞的成骨和增值能力影响,并利用SILAC定量蛋白组学进行筛选蛋白进行分析。 结果：我们的研究中原代培养贴壁细胞是CD54和CD90阳性而CD14和CD34阴性,而且这些细胞具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化的多能分化能力,表明这些分离的细胞属于MSCs。我们的研究还发现,间充质干细胞10-8M地塞米松诱导14天后钙盐沉积能力明显增强,而抗坏血酸和β-甘油磷酸明显增强了地塞米松的成骨分化效果。Real-time PCR和免疫印迹结果支持10-8 M地塞米松处理间充质干细胞7天后TAZ mRNA和蛋白质水平均有提高,免疫组化也表明10-8M地塞米松处理后TAZ阳性的MSCs数量比例显著大于对照组。RU486是一种糖皮质受体拮抗剂，研究表明10-5M RU486拮抗了10-8 M DEX提高TAZ水平的能力。单纯抗坏血酸和β-甘油磷酸没有明显提高TAZ的表达水平。此外,我们的研究发现,10-8 M和10-9 M地塞米松显著提高了大鼠间充质干细胞ALP活性(P<0.01),而10-7 M地塞米松(P<0.05)和10-6 M地塞米松(P<0.01)显著抑制了间充质干细胞的ALP活性,而且10-7 M地塞米松处理间充质干细胞3至7天时显著降低了TAZ的表达水平,提示TAZ的表达和成骨分化活性相关。成骨前体MC3T3-E1细胞10-6M地塞米松治疗7天后,MTT和ALP酶活性检测表明地塞米松抑制了骨前体MC3T3-E1细胞的增值和成骨分化能力。SILAC定量蛋白组学检测发现10-6M地塞米松作用7天抑制了成骨前体细胞的成骨分化和细胞增值能力,上调了微管蛋白(TUBA1A、TUBB2B、TUBB5)、IQGAP1、S100蛋白(S100A11.S100A6、S100A4、S100A10)的表达水平,并下调了G3BP-1和Ras相关蛋白(Rab-1A. Rab-2A、Rab-7)的表达。 结论：我们的研究表明地塞米松在诱导间充质干细胞成骨分化中调节了TAZ的表达,而这种作用与地塞米松的浓度有关。所以TAZ可能不仅是BMP-2诱导成骨分化中的重要通路,而且地塞米松诱导成骨中的信号通路有关。因此,TAZ作为一种β-catenin分子,可能是BMP-2信号通路和Wnt-β-catenin信号通路的重要交叉点。高浓度地塞米松抑制了成骨前体细胞的成骨分化和细胞增值能力。上调的微管蛋白、IQGAP1、S100蛋白以及下调的G3BP-1和Ras相关蛋白可能和地塞米松诱导的细胞成骨分化和增值功能抑制有关。本研究中的成骨分化中糖皮质激素信号通路的调节机制分析可能有助于将来GCOP治疗。