牛蒡根提取物及二咖啡酰基奎宁酸MQA对神经损伤的保护作用及机制研究

随着人口的老龄化,神经退行性疾病的发病率呈逐年增高的趋势。NMDA受体所介导的谷氨酸兴奋性毒性在神经退行性疾病的发生和发展中起着重要作用。NMDA受体过度激活导致钙离子大量内流,触发下游凋亡通路,造成神经元损伤。近期研究提示,由NR2A或NR2B亚单位组成的NMDA受体往往表现出对神经损伤不同的作用。由于非选择性NMDA受体拮抗剂在临床应用中未取得满意的疗效,寻找选择性作用于NMDA受体的NR2B亚单位拮抗剂成为治疗神经退行性疾病的研究热点。而同时具有清除自由基作用的NR2B亚单位拮抗剂,从多个途径阻断神经损伤的发生和发展,很有可能成为一类新的有效的神经保护剂。目的:本课题通过计算机虚拟筛选技术,从天然药物中寻找作用于NMDA受体NR2B亚单位的拮抗剂,并阐明牛蒡根乙酸乙酯萃取层(EAE)及1,5-O-二咖啡酰-3-O-(4-苹果酸甲酯)-奎宁酸(MQA)的抗神经损伤作用机制,为发现具有神经保护活性的先导化合物提供理论依据。方法:(1)通过计算机辅助药物设计技术,对中国传统中药数据库中的41491个天然产物进行虚拟筛选,以筛选出与NMDA受体NR2B亚单位结合较好的化合物。对这些化合物进行分析总结,以进一步寻找含有这些化合物具有潜在神经保护活性的中草药。(2)通过建立体外兴奋性毒性和氧化应激损伤模型,采用MTT法考察所筛选中草药提取物的神经保护作用。(3)通过乳酸脱氢酶释放量、Hoechst 33342荧光染色、Annexin V-FITC/PI双染、抗氧化能力、钙离子内流、ROS和线粒体膜电位(MMP)等实验考察EAE和MQA的保护作用,同时采用Western Blot法检测细胞内Bax/Bcl-2,cleaved caspase-3,ERK,JNK,p38和NR2B等蛋白的表达,初步探索其抗兴奋性毒性和氧化应激损伤的神经保护作用机制。结果:(1)最终筛选到200个与NMDA受体NR2B亚单位结合较好的化合物,来源于91种中草药,其中19种中草药所含化合物有抗神经损伤活性及作用于NMDA受体的文献报道,39种中草药所含化合物有文献报道抗神经损伤活性,但靶点尚不清楚,其余的33种中草药所含化合物抗神经损伤活性未见报道。(2)体外活性测试结果中首次发现牛蒡根、地骨皮、莲子和千里光的神经保护作用,其中牛蒡根的保护作用最强。(3)在谷氨酸诱导PC12细胞损伤模型,EAE可显著增加细胞存活率和抑制LDH释放;EAE显著增加GSH-Px和SOD的活性,减少ROS的产生和MMP的下降;EAE还可降低Bax/Bcl-2的比例,抑制谷氨酸诱导的cytochrome c释放、cleaved caspase-3的蛋白表达增加以及ERK、JNK、p38磷酸化(p<0.05)。(4)在过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型,EAE可显著增加细胞存活率和抑制LDH释放;EAE抗氧化能力较强,通过提高细胞内GSH-Px和SOD的活性,减少MDA含量、ROS生成和MMP的下降;EAE 还可降低 Bax/Bcl-2 的比例,抑制 cytochrome c 释放、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的蛋白表达和酶活性(p<0.05)。(5)在NMDA诱导的SH-SY5Y细胞兴奋性毒性损伤模型,MQA呈剂量依赖性的增加细胞存活率和抑制LDH释放,降低NMDA诱导的SH-SY5Y细胞早期凋亡率;MQA降低Bax/Bcl-2的比例,抑制cytochrome c释放,以及cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的蛋白表达和酶活性;MQA抑制NMDA诱导的ERK、p38和JNK磷酸化,提高CREB、AKT和GSK-3β的磷酸化水平;此外,MQA可抑制NMDA诱导的钙离子内流,降低NR2B亚单位的表达(p<0.05)。(6)在过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型,MQA显著增加细胞存活率和抑制LDH释放,提高SOD的活性,降低MDA含量、ROS产生以及细胞凋亡;MQA降低 Bax/Bcl-2 的比例,抑制 cytochrome c 释放,以及 cleaved caspase-3 和 cleaved caspase-9的蛋白表达;MQA抑制过氧化氢诱导的ERK磷酸化,提高AKT和GSK-3β的磷酸化水平(p<0.05)。结论:(1)计算机辅助药物设计虚拟筛选有助于快速、准确的筛选以NMDA受体NR2B亚单位为靶点的具有神经保护活性的化合物;(2)EAE对谷氨酸诱导兴奋性毒性的保护作用机制与抑制线粒体凋亡途径相关蛋白表达和ERK,JNK,p38磷酸化有关;(3)EAE抗过氧化氢诱导的氧化应激损伤机制与抑制caspase-3和caspase-9的酶活性和线粒体凋亡途径相关蛋白的表达有关;(4)MQA可能通过拮抗NMDA受体NR2B亚单位,抑制NMDA受体过度激活介导的钙内流和线粒体凋亡途径相关蛋白表达,以及作用于MAPKs、AKT/GSK-3β和CREB信号通路,从而发挥抗NMDA兴奋性毒性作用;(5)MQA通过ERK、AKT/GSK-3β信号通路以及抑制线粒体凋亡途径相关蛋白表达发挥抗过氧化氢诱导的氧化应激作用。