地黄梓醇提取分离工艺及其生物活性研究

中药地黄为玄参科植物地黄(Rehmannia glutinosa Libosch．)的新鲜或干燥块根，为常用的补益中药，具有滋阴清热、补血止血等功效，临床应用极为广泛。收载于《中华人民共和国药典》(2005年版，一部)。主产于河南、河北、山东、山西、内蒙古及东北，现全国大部分地区有栽培。化学成分和药理活性研究表明环烯醚萜苷类和糖类是地黄的主要化学成分和活性部位。梓醇是地黄中含量最高的环烯醚萜单糖苷，为地黄的主要活性成分之一，具有利尿、缓和泻下、降血糖、神经保护等生物活性。近年人们对梓醇提取分离的生产工艺进行了许多探索，但由于天然产物成分复杂，含量相对较低，加上梓醇等环烯醚萜苷类化合物结构近似，极性较大，而且化学稳定性较差，因而大量制备纯度在90％以上的单体成分难度较大，到目前为止梓醇大量制备的生产工艺还未得到解决，从而限制了梓醇的生物活性研究与开发应用。 本课题采用适合生产的提取分离方法对梓醇的分离纯化进行了研究，并对其进行了降血糖等生物活性的研究，主要内容和结果如下： 1．在建立梓醇含量测定方法的基础上，以梓醇得率为考察指标，采用正交设计法，对地黄梓醇的最佳提取工艺进行了实验研究。结果表明，以10倍量的80％乙醇提取2次，每次提取1.5 h，提取率达80％以上。并且通过药材的前处理使梓醇在提取分离过程中的稳定性得到了保证。 本文比较了非极性、弱极性、极性三种类型大孔吸附树脂对梓醇的吸附分离效果，结果表明大孔吸附树脂H103是分离纯化梓醇较理想的大孔吸附树脂。地黄的乙醇提取物通过大孔吸附树脂H103柱层析和重结晶处理，得到单体成分梓醇含量大于90％的纯化样品，符合中药、天然药物注册分类1类新药申报要求。其结构通过核磁、质谱和理化性质得到确证。在此基础上对梓醇的生物活性进行了实验研究。 2．根据梓醇的生物活性和地黄对免疫的双向调节作用，采用体内外实验筛选了梓醇的免疫调节活性、对PC12细胞的保护作用和降糖作用。首先，观察了梓醇对KM小鼠免疫器官指数、ConA刺激的脾淋巴细胞增殖反应、混合淋巴细胞反应、Balb／c小鼠异体移植皮片存活时间的影响。接着观察了梓醇对血清饥饿、丙二酸钠损伤的PC12细胞增殖的影响。最后观察了梓醇对正常小鼠葡萄糖致高血糖水平和C2C12细胞葡萄糖消耗的影响。结果表明，梓醇没有明显的免疫调节作用和对PC12细胞的保护作用，但能显著降低正常小鼠葡萄糖致高血糖水平，促进C2C12细胞的葡萄糖消耗。由此进一步观察了梓醇对四氧嘧啶糖尿病小鼠的降糖作用及其作用机制，以及对HepG2细胞的葡萄糖消耗和βTC3细胞的胰岛素分泌的影响。 3．动物实验结果表明，梓醇对四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖升高有明显的抑制作用，同时能显著改善糖尿病小鼠的糖耐量。其作用与临床上常用的降糖药盐酸二甲双胍的降糖效果接近，并且呈剂量依赖关系。血清胰岛素水平和肝脏胰岛素受体数量检测提示，梓醇对糖尿病小鼠的胰岛素分泌没有明显影响，但可显著提高肝脏胰岛素受体的表达。糖脂代谢紊乱是糖尿病并发症的一个重要因素，梓醇能明显提高糖尿病小鼠的肝糖原和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量，降低血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平，提示梓醇能全面调节糖尿病小鼠的糖脂代谢，对糖尿病并发症具有一定的预防作用。血清生化指标肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)，以及肝脏、脾脏的组织形态学观察表明，梓醇对糖尿病小鼠的肝脏、心脏和脾脏功能具有一定的保护作用。细胞实验结果表明，梓醇在高糖条件下可明显增加肝癌细胞HepG2的葡萄糖消耗，但在低糖条件下对HepG2细胞的葡萄糖消耗没有明显影响，同时能增加胰岛素的敏感性，提高胰岛素受体的表达，但对βTC3细胞的胰岛素分泌没有明显影响。以上结果提示，梓醇通过调节糖脂代谢、增加胰岛素的敏感性和胰岛素受体的表达、保护心、肝、脾等脏器免受高血糖损伤等而发挥降糖作用。 4．急性毒性试验结果显示，梓醇小鼠灌胃的MTD大于10 g／kg，为药效学有效剂量的100倍，与正常对照组相比，体重及行为无明显差异，解剖学研究也未发现异常。 以上研究结果将为梓醇的进一步开发利用提供科学依据。