肝纤维化相关microRNA的筛选及其功能研究

研究背景与目的 肝纤维化是各种慢性肝病发展到肝硬化必经的病理改变。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是肝纤维化发生、发展的关键细胞。目前研究认为静息型HSC激活转变为活化型HSC，是肝纤维化发生的中心环节。因此，肝星状细胞活化机制是目前肝纤维化防治的一个研究热点。microRNA是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20～25个核苷酸。microRNA通过碱基互补配对的方式识别靶基因mRNA，并根据互补程度的不同降解靶基因mRNA或者阻遏靶基因mRNA的翻译。microRNA参与多种生物调节途径，包括器官发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。目前国内外关于microRNA在肝星状细胞活化过程中调节作用的报道还很少。因此，本论文研究目的旨在研究microRNA在肝星状细胞活化过程中的调节作用，以深入阐明肝纤维化发病机制中microRNA的重要性，也为肝纤维化的早期干预提供新的思路。 本研究通过分离大鼠原代肝星状细胞和构建DMN大鼠肝纤维化模型，应用高通量microRNA芯片技术，对肝星状细胞活化过程(静息状态—半活化状态—完全活化状态)和DMN肝纤维化模型肝纤维化各期肝组织(S0—S4期)进行microRNA谱检测，筛选并验证与肝纤维化相关的microRNA；miR-335证实在肝星状细胞活化过程中显著降低，通过构建miR-335过表达慢病毒载体，研究miR-335对肝星状细胞增殖、活化与迁移功能的影响，并探讨其可能的机制。研究共分三个部分：⑴大鼠肝星状细胞的分离鉴定与培养；⑵肝星状细胞活化过程(静息状态-半活化状态-完全活化状态)和DMN肝纤维化模型肝纤维化各期肝组织(S0-S4期) microRNA芯片谱其生物信息学分析；⑶miR-335过表达慢病毒载体抑制肝星状细胞活化与迁移及其相关机制研究。 方法 一、 HSC的分离培养与鉴定 雄性Sprague-Darwley大鼠(400g-600g)，分离门静脉并插管，采用酶消化—密度梯度离心法，依次灌注链酶蛋白酶—胶原酶，37℃原位消化，12%Nycodenz密度梯度离心获得HSC，含10%胎牛血清(FBS)的DMEM中培养，隔天更换培养液。328nm紫外光下观察HSC自发荧光，细胞免疫荧光检测细胞Desmin与α-SMA表达，real-time PCR检测细胞TypeⅠcollagen与α-SMA表达，鉴定HSC纯度。 二、肝星状细胞活化过程(静息状态—半活化状态—完全活化状态)和DMN肝纤维化模型肝纤维化各期肝组织(S0—S4期) microRNA芯片谱及其生物信息学分析 (一)肝星状细胞活化各期microRNA芯片谱及生物信息学分析HSC活化各期microRNA芯片检测：肝星状细胞体外培养2天(d2)作为静息状态HSC；培养7天(d7)作为半活化状态状态HSC；培养14天(d14)作为完全活化状态HSC。差异microRNA生物信息学分析：Gene ontology (GO)分析—应用GO分析软件对差异microRNA进行功能分析，得到可能的富集功能，寻找差异microRNA可能与哪些基因功能改变相关；pathway分析—基于KEGG等数据库，得到显著富集的生物信号通路或者代谢通路，寻找差异microRNA可能与哪些细胞通路改变相关。 (二) DMN肝纤维化动物模型构建、各期肝纤维化组织microRNA芯片谱及生物信息学分析DMN肝纤维化动物模型构建及肝纤维化各期肝组织microRNA芯片检测：1%DMN(10ug/kg)每周连续三天腹腔注射，连续四周。每周处死一批大鼠，进行肝组织病理检测及肝功能检测。差异microRNA生物信息学分析：Gene ontology (GO)分析、pathway分析和microRNA-gene-network。 三、 miR-335过表达慢病毒载体抑制肝星状细胞活化与迁移及其相关机制研究 (一) miR-335过表达慢病毒载体的构建及验证miR-335过表达慢病毒载体的构建：将miR-335前体结构插入pLV-CMV-MCS-GFP-FLAG miRNA表达载体(pLV-miR-335)，然后进行病毒质粒的包装、扩增与浓缩，最后形成有效的miR-335过表达慢病毒载体；miR-335过表达慢病毒载体有效性验证：以不同MOI值(MOI取5到50)将miR-335过表达慢病毒载体转染HSC，应用荧光显微镜评估其转染效率，然后应用real-time PCR的方法检测转染前后miR-335表达水平变化。 (二) HSC增殖的检测在96孔培养皿内按1×106cells/ml密度种植原代HSC，无血清DMEM同步化24小时，miR-335过表达慢病毒载体转染细胞3-4天后，应用CCK-8试剂盒检测细胞增殖率。 (三) HSC细胞迁移的检测 1、划痕实验：在6孔培养皿内按1×105cells/ml密度种植HSC，无血清培养基同步化24小时，miR-335过表达慢病毒载体转染细胞3-4天后，用Tip(100ul)尖端同一方向垂直划痕，分别在12h和36h后显微镜下拍照，计算细胞迁移率＝(作用前划痕内面垂直距离－作用后划痕内面垂直距离)/作用前划痕内面垂直距离×100％。 2、Transwell：在24孔板Transwell小室中按1×104cells/well密度种植HSC，无血清DMEM同步化24小时，miR-335过表达慢病毒载体转染细胞3-4天后，用500ul含20%FBS的培养基趋化HSC24小时，结晶紫染色，在显微镜下随机选取5个视野计算迁移细胞数目。 (四) HSC活化的检测 1、应用real-time PCR的方法检测肝星状细胞TypeⅠcollagen与α-SMA mRNA水平的表达； 2、应用Western Blot的方法检测肝星状细胞TypeⅠcollagen与α-SMA蛋白水平的表达。 四、统计学分析数据用均数±标准差表示，数据由SPSS16.0软件统计包处理。多组间的比较用One-WayANOVA方差分析。P<0.05认为有统计学差异。 结果 一、原代大鼠HSC的分离与鉴定 1、328nm紫外光下自发荧光及Desmin、α-SMA细胞免疫荧光检测静息与活化HSC细胞纯度达95%以上，能满足实验需要。 2、应用real-time PCR检测体外培养2天、7天以及14天的HSC活化标志物TypeⅠcollagen与α-SMA mRNA的表达。与2天相比，TypeⅠcollagen与α-SMAmRNA在7天时轻度升高，在14天时显著增加，因此，将HSC2d作为静息状态HSC，7d作为半活化状态HSC，14d作为完全活化状态HSC。 二、DMN肝纤维化动物模型构建随着DMN给药时间的延长，肝功能逐渐降低，肝纤维化程度逐渐加重，至第四周给药后，已能观察到明显的肝硬化甚至伴有失代偿症状(出现腹水)。根据肝组织病理结果，DMN给药第一周作为肝纤维化S1期，给药第二周作为肝纤维化S2期，给药第三周作为肝纤维化S3期，给药第四周作为肝纤维化S4期。 三、肝星状细胞活化各期microRNA芯片谱及生物信息学分析 1、17个microRNA (miR-345-5p、miR-152、miR-199a-5p、miR-218、miR-125b-5p、miR-214、miR-34c、miR-34b、miR-199a-3p、miR-425、miR-221、miR-301a、miR-222、miR-193、miR-31、miR-143、miR-145)在肝星状细胞活化过程中表达逐渐升高；14个microRNA(miR-101a、miR-335、miR-877、miR-139-5p、miR-150、miR-126*、miR-192、miR-450a、rno-miR-497、rno-miR-338、rno-miR-10a-5p、rno-miR-378*、rno-miR-195、miR-126)在肝星状细胞活化过程中表达逐渐降低。 2、生物信息学分析： (1)GO分析：28个GOs被肝星状细胞活化过程中上调的microRNA调节，31个GOs被肝星状细胞活化过程中下调的microRNA调节； (2)GO-Map分析：GO-Map显示最主要的GOs为神经元分化、信号转导、囊泡介导的运输、细胞处理、细胞分化、细胞增殖正向调控、应激反应、G蛋白偶联受体信号通路、蛋白质氨基酸磷酸化以及细胞迁移； (3)pathway分析：Phosphatidylinositol signaling system、Wnt signaling pathway、mTOR signalingpathway、Focal adhesion、ECM-receptor interaction、Notch signaling pathway、T cellreceptor signaling pathway、TGF-beta signaling pathway、Regulation of actincytoskeleton、Insulin signaling pathway、MAPK signaling pathway、VEGF signalingpathway、Hedgehog signaling pathway等可能被肝星状细胞活化过程中上调的microRNA所调节； TGF-beta signaling pathway、mTOR signaling pathway、Wnt signaling pathway、Adherens junction、Non-small cell lung cancer、Pancreatic cancer、Bladder cancer、Phosphatidylinositol signaling system、Prostate cancer、Glioma、SNARE interactionsin vesicular transport、O-Glycan biosynthesis、Hedgehog signaling pathway、Focaladhesion、VEGF signaling pathway、MAPK signaling pathway、Insulin signalingpathway等可能被肝星状细胞活化过程中下调的microRNA所调节。 四、DMN肝纤维化模型肝纤维化各期肝组织(S0-S4期) microRNA芯片谱及其生物信息学分析 1、10个microRNA (miR-34b、miR-34c、miR-34a、miR-221、miR-146b、miR-214、miR-199a-5p、miR-199a-3p、miR-223、miR-324-5p)在肝纤维化过程中表达逐渐升高；5个microRNA (miR-878、miR-193、miR-378、miR-92a、miR-19a)在肝纤维化过程中表达逐渐降低。 2、生物信息学分析(GO分析和pathway分析)： (1)GO分析：15个GOs被肝纤维化过程中表达上调的microRNA调节，10个GOs被肝纤维化过程中表达下调的microRNA调节。 (2)pathway分析：Glycerophospholipid metabolism、Pyruvate metabolism、Lysine degradation、Proteasome、Reductive carboxylate cycle (CO2fixation)、Benzoate degradation viaCoA ligation、Riboflavin metabolism、Focal adhesion、PPAR signaling pathway、MAPK signaling pathway、mTOR signaling pathway等可能被肝纤维化过程中表达上调的microRNA调节；Butanoate metabolism、Arginine and proline metabolism、Cell cycle、Glioma、Insulinsignaling pathway、MAPK signaling pathway、Focal adhesion、Regulation of actincytoskeleton、ECM-receptor interaction、Fatty acid metabolism、TGF-beta signalingpathway等可能被肝纤维化过程中表达下调的microRNA调节。 (3) microRNA-gene-network分析：得到网络中关键的microRNA以及被调控最多的靶基因。 五、miR-335过表达慢病毒载体构建及验证 1、应用real-time PCR技术证实，miR-335、miR-150的表达在HSC活化过程中显著下调，miR-221、miR-143、miR-145的表达在HSC活化过程中显著上调，与芯片检测结果符合。 2、选取miR-335进行功能研究，构建miR-335过表达慢病毒载体，MOI值为50时，miR-335过表达慢病毒载体HSC转染效率达90%以上，real-time PCR检测miR-335过表达慢病毒载体转染HSC后miR-335的表达量增加175倍，恢复到静息状态HSC水平，证实miR-335过表达慢病毒载体构建成功。 六、miR-335过表达慢病毒载体对HSC活化的影响 miR-335过表达慢病毒载体转染HSC后明显抑制HSC活化标志物TypeⅠcollagen与α-SMA mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。real-time PCR和Westernblot结果显示，α-SMA mRNA和蛋白的表达被miR-335过表达分别抑制了70%和31%；TypeⅠcollagen mRNA和蛋白表达分别被抑制了53%和20%。 七、miR-335过表达慢病毒载体对HSC迁移的影响 1、Transwell结果显示，miR-335过表达抑制HSC迁移的40%(P<0.05)； 2、细胞划痕实验结果显示，miR-335过表达抑制HSC迁移的45%(P<0.05)。 八、miR-335过表达慢病毒载体对HSC增殖的影响正常组、阴性对照组、miR-335过表达组三组细胞应用CCK-8法检测细胞增殖率，连续监测5天，三组细胞增殖率之间无统计学差异。 九、miR-335过表达慢病毒载体对TNC表达的影响 1、TNC mRNA和蛋白的表达量在HSC活化过程中显著升高； 2、miR-335过表达显著降低TNC mRNA和蛋白的表达量。real-time PCR和Western blot结果显示，TNC mRNA和蛋白的表达量分别被抑制了76%和74%。 十、TNC对HSC迁移功能的影响 给予外源性TNC (20ug/ml; CC115; Chemicon)，HSC增值率未见明显改变，但HSC迁移率提高50%。 结论 一、在肝星状细胞活化过程中，17个microRNA在肝星状细胞活化过程中表达逐渐升高，14个microRNA在肝星状细胞活化过程中表达逐渐降低；在肝纤维化进展中，10个microRNA在肝纤维化过程中表达逐渐升高；5个microRNA在肝纤维化过程中表达逐渐降低。生物信息学分析显示，多个和肝纤维化发生密切相关的基因功能以及细胞信号转导通路如细胞迁移、TGF-beta signaling pathway、VEGF signaling pathway等等均受到这些肝纤维化相关microRNA的调控，提示microRNA可能在细胞和组织层面上都参与了肝纤维化发生发展的调控。二、miR-335的表达量在肝星状细胞活化过程中显著降低，miR-335过表达显著抑制肝星状细胞的活化及迁移，可能是通过下调TNC的表达量而实现。