成骨细胞特异性识别多肽对人成骨细胞增殖和矿化影响的实验研究

研究以人颅骨成骨细胞为靶细胞,人牙龈成纤维细胞为吸附细胞对噬菌体十二肽库进行全细胞差减筛选,获得与人成骨细胞特异性结合多肽,其氨基酸序列为:VLAVPWSEPGYL。本研究的目的旨在探讨人成骨细胞特异性识别多肽对人成骨细胞增殖和矿化功能的影响,摸索并确定成骨细胞特异性识别多肽体外促进人成骨细胞增殖矿化的最佳有效浓度,为该特异性多肽的进一步研究及应用提供实验基础。具体研究内容和结果如下:第一部分:MTT法检测人成骨细胞的增殖体外常规培养人颅骨成骨细胞,用α-MEM培养基将成骨细胞特异性识别多肽配制成五种不同的浓度,分为5个实验组(10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L)以及空白对照组,分别于4,7 d进行MTT检测,获得的实验数据进行统计学分析。结果表明:在此浓度范围的成骨细胞特异性识别多肽能促进人颅骨成骨细胞的增殖(P<0.05),其最佳有效作用浓度是10-5mol/L。第二部分:碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测体外常规培养人颅骨成骨细胞,用α-MEM培养基将成骨细胞特异性识别多肽配制成五种不同的浓度,分为5个实验组(10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L)以及空白对照组,分别于第4、7 d取出细胞,按照ALP检测试剂盒以及BCA蛋白法步骤进行检测。将ALP活性除以测得的细胞总蛋白即可得到单位蛋白含量的相对ALP活性,获得的实验数据进行统计学分析。结果表明:在此浓度范围的成骨细胞特异性识别多肽能促进人颅骨成骨细胞ALP活性的表达(P<0.05),其最佳有效作用浓度是10-4mol/L。第三部分:茜素红染色及半定量分析检测人成骨细胞钙化程度体外常规培养人颅骨成骨细胞,用α-MEM培养基将成骨细胞特异性识别多肽配制成五种不同的浓度,分为5个实验组(10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L)以及空白对照组,分别于第14、21 d取出细胞,漂洗,固定,茜素红染色,扫描仪扫描照片。每孔加入氯化十六烷基吡啶,待茜素红溶解后,测得吸光度值,获得的实验数据进行统计学分析。结果表明:在此浓度范围的成骨细胞特异性识别多肽能促进成骨细胞的钙盐沉积,半定量分析结果显示在浓度10-5mol/L时,吸光度(OD)值最高,但实验组与对照组之间差异无统计学意义。第四部分:RT-QPCR检测人成骨细胞骨钙素(OCN)m RNA的表达体外常规培养人颅骨成骨细胞,用α-MEM培养基将成骨细胞特异性识别多肽配制成五种不同的浓度,分为5个实验组(10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L)以及空白对照组,分别于于第14、21 d取出细胞,提取RNA进行逆转录,使用RT-QPCR检测试剂盒检测,获得的实验数据进行统计学分析。结果表明:在此浓度范围的成骨细胞特异性识别多肽能促进成骨细胞OCNm RNA的表达(P<0.05),其最佳有效作用浓度10-6mol/L。总结:成骨细胞特异性识别多肽在10-8～10-4mol/L浓度范围能够促进人颅骨成骨细胞的增殖和矿化,且在10-5mol/L浓度促进成骨细胞增殖及矿化相关蛋白表达最为显著。