IL-9在退变椎间盘自身免疫炎症反应中的作用及机制研究

椎间盘退变（Intervertebral disc degeneration,IDD）是导致腰背痛及椎间盘源性腰痛的最常见原因,给患者个人家庭及社会带来极大的经济负担。IDD的特征为椎间盘发生广泛的形态学和生物力学变化,椎间隙高度减低,椎间盘结构破坏,脊柱活动度下降,最终导致椎间盘生物力学功能丧失,同时引起下腰痛等临床症状。椎间盘退变主要的生化改变为椎间盘内软骨样髓核细胞出现变性及坏死,髓核细胞功能降低和数量减少,髓核细胞外基质中II型胶原（Type II collagen,Col II）、蛋白聚糖等功能性基质大分子丢失造成细胞赖以生存的环境被破坏。炎性介质在椎间盘退变过程中发挥着重要的作用。炎症因子在椎间盘退变过程中通过引起炎症反应、诱导细胞凋亡,破坏椎间盘的组织结构。研究证明,TNF-α、白细胞介素-1β（Interlukin-1β,IL-1β）、白介素 17（Interlukin-17,IL-17）、前列腺素E2（Prostaglandin GE2）、环氧化酶-2（COX-2）、一氧化氮（NO）等炎症因子在椎间盘退变进程中起重要作用。炎症因子主要通过引起炎症反应、诱导细胞凋亡等途径,促进椎间盘退变;同时椎间盘组织内炎症因子相互作用发生级联反应,进一步加剧椎间盘组织的炎症反应,加速椎间盘退变。IL-9最初被认为是一种T淋巴细胞生长因子,主要由活化的CD4+Th9细胞分泌,此外肥大细胞、嗜酸性细胞、中性粒细胞、其他淋巴细胞亚群也可以少量分泌。研究表明,IL9在炎症反应中能够趋化炎症细胞,促进炎症因子表达,加剧炎症反应。目前,越来越多的证据表明Th9细胞和IL-9可能与人体炎症反应和自身免疫炎性疾病的发病机制相关。IL-9在多种自身免疫炎症疾病,如哮喘、免疫性脊髓炎、骨性关节炎及炎症性肠炎中发挥了重要作用。研究表明,IL-9可以促进IL-4介导B细胞分化及IgE的表达,此外IL-9还能够促进活化T细胞和肥大细胞增殖,从而促进过敏反症的发生。IL-9作为一种细胞因子可以通过调节嗜酸粒细胞的成熟和聚集,促进支气管上皮细胞表达T细胞趋化因子,从而促进过敏性哮喘的发展。在自身免疫性炎性反应方面,Nowak等在实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）小鼠模型中发现,IL9能够影响中枢神经系统IL-17A和IL-6的表达。体外试验证明,IL-9促进股骨头坏死患者的关节软骨细胞表达、释放TNF-α、COX2等炎性因子,IL-9以浓度依赖和时间依赖方式促进关节软骨细胞分泌大量TNF-α、PGE2等炎症因子,进一步放大髋关节局部的免疫炎症反应。在退变椎间盘组织中,IL-9是否诱导髓核细胞TNF-α的表达及PGE2的产生,并通过二者发挥致炎作用,导致椎间盘内炎症反应,尚无明确研究。IL-9在椎间盘组织内作用的具体作用机制也不明确本研究主要分为两部分:第一部分主要探索IL-9及TNF-α在退变椎间盘的表达情况,明确IL-9及TNF-α是否参与椎间盘炎性退变的病理生理过程;第二部分主要通过体外实验探讨IL-9调控退变髓核细胞分泌TNF-α和PGE2的影响,.进一步明确IL-9的在椎间盘自身免疫炎症反应中的作用机制。第一部分:IL-9、TNF-α在退变椎间盘组织及血清表达的研究研究目的:椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IDD）是导致腰背痛和腰椎间盘突出的最常见原因。近年来,突出或脱出的退变椎间盘组织所诱发的炎症反应和自身免疫反应导致神经根炎性疼痛的观点受到重视。前期研究表明辅助性T淋巴细胞9（Thelper 9,Th9）细胞及其相关细胞因子IL-9在自身免疫性疾病中发挥重要作用。本研究通过检测椎间盘突出患者椎间盘组织中IL-9和TNF-α的表达,明确IL-9及TNF-α是否参与椎间盘炎性退变的病理生理过程。研究方法:选取2012年10月-2015年10月在山东大学齐鲁医院骨外科住院、同时经临床表现、体格检查和影像学检查明确诊断为腰椎间盘突出症患者。40例患单节段椎间盘突出症病人的椎间盘组织以及5例脊柱外伤病人的椎间盘组织,根据影像学检查和临床表现分为突出组（Group P）、脱出组（Group E）和正常对照组（Control Group）。免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色检测各组退变椎间盘组织中IL-9和TNF-α的表达,观察上述指标在各组退变椎间盘的表达变化及定位;蛋白印迹法（Western blot）检测各组退变椎间盘组织IL-9和TNF-α蛋白表达水平;应用实时定量荧光聚合酶链式反应（real-time PCR）观察各组椎间盘组织中1L-9和TNF-αmRNA含量变化。收集患者外周血,酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测各组病人外周血血清中IL-9浓度水平。最后,根据各组退变椎间盘的Pfirrmann分级评分和IL-9血清浓度的变化进行Spearman相关分析。研究结果:首先,退变椎间盘组织IHC结果表明,突出组（Group P）和脱出组（Group E）退变椎间盘中有IL-9的表达,脱出组（Group E）退变椎间盘组织中IL-9和TNF-α表达明显高于突出组。Western blot结果同样显示脱出组（Group E）退变椎间盘组织中IL-9和TNF-α蛋白含量明显较突出组（Group P）含量升高。Real-time PCR结果显示脱出组（Group E）退变椎间盘组织中IL-9和TNF-αmRNA的表达含量与突出组（GroupP）相比显著提高。ELISA结果显示,与正常对照相比,突出组（Group P）和脱出组（Group E）病人外周血IL-9浓度水平明显提高。最后,Spearman相关分析结果显示,各组退变椎间盘的Pfirrmann分级评分和IL-9血清浓度变化存在显著性相关性。研究结论:IL-9和TNF-α可能是椎间盘退变自身免疫反应过程中重要的致炎因子。IL-9无论在退变椎间盘组织中或外周血血清中均表达增多;外周血中IL-9分泌细胞趋化迁移至退变椎间盘组织局部炎症部位,与椎间盘中的炎症因子TNF-α共同相互作用,激活、级联放大椎间盘组织的自身免疫反应,促进椎间盘组织的进一步退变。第二部分:IL-9对退变髄核细胞自身免疫炎症反应的机制研究研究目的:腰椎间盘退变的自身免疫炎症反应机制理论逐渐受到大多数学者的重视。椎间盘组织内的髓核是人体最大的无血供组织,特殊的组织结构使其成为机体的免疫豁免组织,椎间盘髓核组织突出后可激活局部强烈的自身免疫应答,进而导致慢性炎症发生并产生促炎因子级联放大效应,进一步促进椎间盘退变。退变椎间盘组织中及外周血血清中IL9均表达増多;同样,TNF-ot作为重要的促炎因子在退变椎间盘组织中表明显升高,而IL-9和相关的效应炎症因子,包括TNF-a和PGE2的相互作用机制还没有被阐明。本研究进行原代髓核细胞培养,通过体外实验探讨IL-9调控退变髓核细胞分泌TNF-a和PGE2的影响,进一步明确IL-9的在椎间盘自身免疫炎症反应中的作用机制。研究方法:选择2012年10月-2015年10月在山东大学齐鲁医院骨外科住院并经影像学检查和临床表现确诊的40例腰椎间盘突出症患者。选择其中20例腰椎间盘突出症患者髓核组织提取原代髓核细胞进行培养,取第3代髓核细胞加入IL-9单独刺激后进行培养,同时确定了IL-9单独刺激的不同浓度梯度（0 ng/ml、lng/ml、10ng/ml、100ng/ml）及时间梯度（0h,12h,24h,48h）。细胞免疫焚光染色（Immunofluorescence Staining）检测退变髓核细胞中TNF-a的定位及荧光强度;收集不同IL-9刺激的浓度梯度和时间梯度培养的退变髓核细胞,提取细胞总蛋白,蛋白质印迹法（Western blot）检测退变髓核细胞中TNF-a的表达情况;实时定量荧光聚合酶链式反应（real-time PCR）观察退变髓核细胞中TNF-a mRNA含量变化;IL-9单独刺激后收集髓核细胞培养上清液,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清液中的TNF-a和PGE2浓度。研究结果:通过IL-9单独不用浓度下（0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml）刺激退变髓核细胞,细胞免疫焚光试验结果表明随着IL-9刺激浓度的升高,髓核细胞表达TNF-a的荧光强度也增高;蛋白印迹试验（Western blot）结果表明,IL-9能显著提高髓核细胞表达TNF-a蛋白水平,且存在浓度依赖性和时间依赖性;同样,Real-time PCR结果显示IL-9能显著提高髓核细胞中TNFamRNA的表达水平,同时存在浓度依赖性和时间依赖性;ELISA检测结果显示通过IL-9单独刺激髓核细胞,细胞培养上清液中TNF-a和PGE2浓度升高,且存在浓度依赖性和时间依赖性。IL-9刺激髓核细胞分泌TNF-a,TNF-a表达的增多,椎间盘局部炎症因子浓度升高,进而使椎间盘组织基质降解过度增加,炎症因子集聚,导致椎间盘组织退变。研究结论:IL-9是可能是椎间盘退变自身免疫反应过程中重要的促炎因子。IL-9通过刺激髓核细胞分泌TNF-a和PGE2等炎性介质,同时形成正反馈环路,进一步加速椎间盘的退变,从而在椎间盘退变的炎症反应过程中起着重要的促炎作用。