目的以山茱萸水提液为研究对象,采用膜分离技术富集山茱萸总苷,通过体内、体外药效学,研究膜分离技术对山茱萸水提液中山茱萸总苷类成分抗炎生物活性的影响,以评价膜分离技术应用于精制山茱萸水提液的适用性,为膜分离技术在中药精制方面的进一步应用提供研究基础。方法1.采用LNG-CM-101实验室小型微滤陶瓷膜设备(微滤膜孔径:0.8μm、0.2μm和0.05μm)和LNG-HFM-101小型中空纤维超滤膜设备(超滤膜截留分子量:50 k Da、10 k Da和6 k Da)对山茱萸水提液进行精制处理,以有效活性成分山茱萸总苷透过率和高分子(蛋白质、果胶、鞣质、淀粉)截留率为综合评价指标,利用响应面法优选山茱萸水提液的膜分离精制工艺。2.采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测山茱萸原液、膜微滤液及超滤液对人成纤维滑膜细胞(HFLS)增殖的影响,并检测山茱萸各样品对白介素(IL)-1β及肿瘤坏死因子(TNF)-α诱导的血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素(IL)-6的抑制作用,从体外药效学方面评价膜分离技术富集山茱萸水提液抗炎组分的适用性。3.通过建立佐剂性关节炎大鼠模型,测定山茱萸原液、膜微滤液、膜超滤液及白芍总苷(TGP)对AA大鼠足趾肿胀和体重的影响。用ELISA法检测佐剂性关节炎大鼠血清中IL-1、IL-6、前列腺素(PGE2)和TNF-α的含量,HE染色后通过显微镜法观察病理切片,比较不同样品对佐剂性关节炎大鼠的治疗效果。结果1.山茱萸水提液膜微滤最佳工艺条件为:膜孔径0.05μm,药液温度40-45℃,药液质量浓度0.10 g·m L-1左右,过膜压力0.07 MPa;膜超滤最佳工艺条件为:超滤膜截留分子量10 k Da,药液温度50-55℃,药液质量浓度0.13g·m L-1左右,过膜压力0.10 MPa。山茱萸水提液经膜精制后,溶液的浊度、黏度、粒径、色差等理化参数得到明显的改善,提高了溶液的澄明度,降低溶液中的悬浮性大颗粒及高分子物质,且使有效成分得到了很好的保留。2.体外药效学实验结果表明,山茱萸原液、膜微滤液及膜超滤液能有效抑制IL-1β诱导产生的过量炎症细胞因子VEGF、TNF-α、IL-6和TNF-α诱导产生的过量的炎症细胞因子VEGF、IL-6。山茱萸水提液经膜精制后增强了其抗炎活性,且以膜超滤精制液抗炎活性最好。3.体内药效学实验结果表明,山茱萸原液、膜微滤液及膜超滤液能显著下调佐剂性关节炎(AA)大鼠血清中炎性细胞因子IL-1、IL-6、PGE2、TNF-α的水平,改善AA大鼠的炎症程度,其中以膜超滤精制液的效果最好。病理组织切片结果表明,山茱萸各样品能抑制AA大鼠滑膜细胞增生,降低炎性细胞浸润程度。结论采用响应面法优化了山茱萸水提液的膜微滤及膜超滤工艺。通过对不同膜分离技术获得的山茱萸样品体外抗炎作用的研究,初步阐明了其作用机制与抑制滑膜细胞过度分泌炎性细胞因子有关。通过对不同膜分离技术获得的山茱萸样品的体内抗炎作用的研究,发现山茱萸水提液经膜精制后抗炎作用增强,且以截留分子量为10 k Da的中空纤维膜精制所得的超滤液效果最佳。
