复方柴归方抗抑郁有效组分筛选及其药效学评价研究

选题依据：抑郁症是常见的情感性或心理性疾病。研究显示：目前,中国大约有抑郁症患者3000万人,全球范围内有超过5亿人正遭受着抑郁症的折磨,其终身患病率高达20%。然而,目前治疗抑郁症的药物不甚理想,主要以化学药物为主,如单胺氧化酶抑制剂、三环类抗抑郁药、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂等,但这些药物都存在治疗谱窄、不良反应大、耐受性差以及价格昂贵等问题[1-3],而近年国内学者发现中药(特别是复方)治疗抑郁症在改善症状、降低复发率、减少西药副作用方面具有独特效果。本课题依据临床报道逍遥散(丸)在抑郁症治疗上显示出的独特效果,在前期研究基础上,从逍遥散类方中筛选出逍遥散为最佳抗抑郁复方,又依逍遥散最佳抗抑郁组分的化学成分分析和药效学筛选,得出复方柴归方(红柴胡、香附、青皮、甘草、生姜、薄荷),对该方抗抑郁有效组分进行系统而完善的工艺筛选、药效学实验及安全性初步评价等规范化研究工作。 目的：基于中医整体观研究思路,从行为学和1H-NMR代谢组学两个方面验证复方柴归方代替逍遥散原方的可行性,并对其制备工艺、最佳给药剂量及安全性等方面进行初步探究。 方法：在前期从逍遥散类方中筛选出逍遥散为最佳抗抑郁复方的基础上,进一步对其君药基源进行筛选；依据实验室前期筛选出逍遥散石油醚组分为最佳抗抑郁有效组分基础上,并且采用HPLC-UV法、HPLC-ELSD法、GC-MS法等化学成分分析方法对逍遥散全方及单味药材进行化学成分归属分析的研究结果,对去掉“白芍”和“茯苓”的“复方柴归方”(红柴胡30g,香附30g,青皮30g,甘草15g,薄荷10g,生姜10g)石油醚组分采用小鼠悬尾实验和小鼠强迫游泳实验与逍遥散原方石油醚组分进行药效学比较；在确定了复方柴归方及其最佳比例的基础上,探索了对可代替石油醚萃取的制备工艺,拟定了无毒、无污染、高效率的超临界C02流体萃取方法得到复方柴归方超临界C02有效组分。采用小鼠悬尾实验和小鼠强迫游泳实验对该组分与石油醚组分进行抗抑郁药效活性比较。运用正交实验研究超临界CO2最佳工艺参数条件,并从产率以及行为学两个指标确定其最佳工艺参数,同时对复方柴归方不同药材组合提取方法得到的超临界CO2有效组分进行抗抑郁活性筛选；在确定了复方柴归方及其超临界C02最佳萃取工艺条件的基础上,萃取该方有效组分,采用慢性温和不可预知性应激抑郁模型(CUMS)从行为学和1H-NMR代谢组学两个方面对该方有效组分展开药效学评价；应用小鼠急性毒性实验和大鼠长期毒性预实验对其安全性进行初步探究。 结果：1.不同品种柴胡组成的逍遥散都具有明显的抗抑郁作用,但功效有所差别,即红柴胡组成逍遥散的抗抑郁效果及起效时间略优于北柴胡,但无统计学差异。 2.通过实验室前期对逍遥散最佳抗抑郁有效组分筛选以及进行化学成分归属分析后发现逍遥散中的“白芍”和“茯苓”两味药材的石油醚组分对复方石油醚组分的化学成分几乎无贡献的研究结果。本实验拟去掉“白芍”和“茯苓”这两味药形成复方柴归方(红柴胡30g,香附30g,青皮30g,甘草15g,薄荷10g,生姜10g),对复方柴归方石油醚组分采用小鼠悬尾实验和小鼠强迫游泳实验与逍遥散石油醚组分进行药效学比较。结果表明复方柴归方石油醚组分与原逍遥散方石油醚组分抗抑郁效果相当。 3.复方柴归方超临界CO2有效组分与其石油醚组分进行药效学验证。实验结果表明超临界C02有效组分与石油醚组分对于小鼠不动时间的减少没有统计学差异。说明了超临界CO2流体萃取工艺代替石油醚萃取工艺的可行性。运用正交实验摸索了超临界CO2萃取复方柴归方有效组分的最佳工艺参数。并对最佳提取工艺条件进行药效学验证,最终研究结果表明复方柴归方超临界CO2有效组分抗抑郁效果明确,最佳工艺参数为萃取压力20MPa,萃取温度50℃,C02流量55kg/h,物料粒度20目,萃取时间3h,得率为2.2%。同时对复方柴归方不同药材组合提取方法得到的超临界CO2有效组分进行抗抑郁活性筛选,结果表明复方柴归全方超临界CO2提取物抗抑郁效果最佳。 4.采用慢性温和不可预知性应激抑郁模型(CUMS)从行为学和1H-NMR代谢组学两个方面对复方柴归方超临界CO2有效组分进行药效学评价。行为学结果表明实验前各组大鼠的体重、糖水偏爱率及各项行为学指标均无统计学意义。在造模第21天时,空白对照组和模型组在各项指标均具有统计学差异。结果显示在实验第21天时造模成功,各给药组中复方柴归中剂量组对CUMS模型的干预效果最佳。 尿液NMR代谢组学结果分析：采用NOESY核磁序列对大鼠尿液中的代谢物进行分析,结合单变量的统计学分析方法,对代谢物的主成分分析得到的载荷图中离原点远的那些代谢物在空白对照组和模型组中的峰面积进行独立样本t检验,计算P值。只有P值小于0.05的代谢物为具有统计学意义的潜在生物标志物。结果显示,与空白对照组大鼠相比,模型组能引起大鼠尿液中醋酸、丙酮酸、琥珀酸、2-氧化戊二酸、柠檬酸、甘氨酸等含量的变化。复方柴归中剂量组能较好地调节这些与抑郁相关的潜在生物标志物。 5.初步安全性评价结果表明复方柴归方超临界C02有效组分毒性较低、副作用小、在一定的剂量范围内使用安全。 结论：1.复方柴归方来源于传统中药逍遥散,由红柴胡、香附、青皮、甘草、生姜和薄荷等组成,其中的低极性组分抗抑郁效果确切,对逍遥散原方具有可代替性。 2.不同抑郁症动物模型实验结果均表明,采用天然、无毒、无污染的超临界流体CO2萃取工艺制备而成的复方柴归方有效组分的抗抑郁效果确切,且略优于其石油醚组分。说明了超临界C02萃取工艺的可行性。 3.复方柴归方超临界C02有效组分安全性较高、具备了作为组分新药候选药物进行深入开发的条件。