甜瓜接种白粉病菌后多胺变化及CmSAMDC基因的功能鉴定

甜瓜(Cucumis melo L.)为葫芦科甜瓜属一年生藤蔓类草本植物，在我国及世界范围内广泛栽培。然而，随着其设施栽培面积的不断扩大，白粉病的危害已成为甜瓜栽培中的主要障碍之一，严重影响着甜瓜的产量和品质。而大量杀菌剂的使用不仅使病菌易产生抗药性，对环境也会造成严重污染。因此，通过对抗病种质抗病基因的挖掘和利用，进而选育白粉病抗性品种成为防治该病害的有效方法。前期研究已表明，中国野生甜瓜‘Yuntian930’是对白粉病菌(Podosphaera xanthii)生理小种2F.表现高抗的品种，通过cDNA-amplified fragment length polymorphism(cDNA-AFLP)技术在其与白粉病菌互作中获得了大量差异转录本，功能涉及转录调控、多胺合成代谢、信号转导等过程。然而，对该种质的生理及分子抗病机制了解还很有限。 本研究首先从结构抗性上对不同抗性甜瓜材料进行了叶片结构的比较观察，并选取抗病性具明显差异的两个甜瓜品种(高抗品种‘Yuntian930’和感病品种‘0544’)为试材，通过喷施外源亚精胺(Spermidine, Spd)和二环己胺(Dicyclohexylamine, DCHA)处理，研究白粉病菌接种下甜瓜幼苗的病情指数、光合特性、抗氧化系统、多胺代谢及相关基因表达等方面的变化，探讨叶片结构、抗氧化酶活性、内源多胺代谢以及施用外源多胺对甜瓜抵御白粉病菌侵染的作用；同时利用数字基因表达谱(Digital gene expression profiling,DGE)技术对高抗品种‘Yuntian930’在接种白粉病菌后不同时间点的基因差异表达进行系统分析；并对其中呈显著上调表达的差异基因CmSAMDC进行克隆、分析鉴定及拟南芥中异源超表达，以探究该基因在抵抗白粉病菌侵染中的作用。主要研究结果如下： 1.对不同抗性甜瓜叶片结构观察显示，抗病品种‘Yuntian930’和‘0426’的刺毛密度、叶片紧密度、栅栏组织/海绵组织比值(栅/海比)均高于感病品种‘0544’和‘066’，并达到显著性水平；叶片的表皮细胞厚度、栅栏组织及海绵组织厚度、气孔大小及密度在抗、感品种间没有明显规律。表明甜瓜叶片的刺毛、栅栏组织及蜡质层可作为一种结构屏障抵抗白粉病菌的侵入，而叶片紧密度、栅/海比、刺毛密度、蜡质含量可作为甜瓜白粉病抗性育种的辅助鉴定指标。 2.对不同抗性甜瓜接种白粉病菌后显示，‘Yuntian930’的多酚氧化酶(Polyphenoloxidase, PPO)、过氧化物酶(Peroxidase, POD)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)酶活性均较‘0544’要高或上升更早，并且‘Yuntian930’的过氧化氢(Hydrogen peroxide, H2O2)含量也较‘0544’更早上升；‘Yuntian930’的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethioninedecarboxylase, SAMDC)、鸟氨酸脱羧酶(Ornithine decarboxylase, ODC)、精氨酸脱羧酶(Arginine decarboxylase, ADC)、多胺氧化酶(Polyamine oxidase, PAO)基因的表达峰值较‘0544’更早出现，表达量更高，并且这些基因的产物腐胺(Putrescine, Put)、亚精胺(Spermidine, Spd)和精胺(Spermine, Spm)含量也比‘0544’高。表明在受到白粉病菌侵染时，抗性甜瓜能通过协调多胺类基因的表达和内源多胺的含量变化、激发防御酶活性来应对病菌侵染带来的伤害。 3.外源Spd处理甜瓜品种‘0544’显示，外源Spd诱导了甜瓜多胺类基因的上调表达及多胺含量的升高，尤其是Spd和Put的升高更为明显；白粉病菌侵染下，甜瓜通过提高PPO、POD、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性来清除过多的活性氧，并产生抗性物质来抵御白粉病菌的侵染，而1mM浓度的外源Spd处理能诱导甜瓜增强这种抗性反应，减轻植株的发病症状。 4.外源DCHA处理甜瓜‘Yuntian930’显示，5mM浓度的DCHA在48h内降低了Spd的含量，对Put含量没有影响，但促进了Spm的积累；在48h之后，伴随着多胺合成类基因的上调表达，Spd含量与其他两种多胺均出现上升趋势；外源DCHA处理48h后也诱导了甜瓜POD、SOD、PPO酶活性的升高，并降低了接种植株的病情指数。 5. DGE分析显示，接种白粉病菌后，‘Yuntian930’在24h产生的差异基因数量较少，为219个，处理后48h和72h分别达1784和2371个，其中上调表达的基因数量多于下调表达基因数量；差异基因涉及到光合系统、蛋白核酸代谢、次生物质代谢、碳代谢及细胞信号转导等过程；同时发现，在接种后48h有5个多胺生物合成类基因和1个多胺代谢类基因呈上调表达，表明多胺合成代谢途径参与了白粉病菌侵染的响应过程。 6.从甜瓜中克隆了SAMDC基因，序列分析显示其主开放阅读框长1095bp，编码364个氨基酸，具有该类基因明显的两个保守结构域。并且发现，该基因在两个不同抗性品种中的核苷酸序列存在7个碱基差异，编码3个不同的氨基酸，但都处于非保守区；对中国野生甜瓜‘Yuntian930’的SAMDC基因命名为CmSAMDC，其亚细胞定位于细胞质、细胞膜及细胞核中，并在BL21(DE3)原核菌株中成功表达；将CmSAMDC基因构建植物超表达载体转入拟南芥中发现，转基因植株增强了对白粉病的抗性和耐盐性，并导致了转基因植株激素含量的升高。