人CYP1A2与CYP2E1野生型酵母表达系统的建立和CYP1A2荧光药物筛选平台的建立

人类细胞色素P450（Cytochrome P450,CYP）对许多内源性和外源性的化学物质及环境有害化学物质具有生物转化作用。其中CYP1A2是P450酶系重要的亚族之一,约占肝脏CYP酶总量的15%,居肝脏各CYP酶含量的第三位。CYP1A2参与许多前致癌物的代谢激活作用,CYP1A2还代谢多种药物,同时也负责一些内源性激素的羟化反应。CYP1A2活性存在很大的个体间差异,其遗传多态性有可能会影响个体的癌症易感性和一些药物治疗效果的个体差异。CYP2E1也是重要的前致癌物代谢酶,主要底物为亲脂性的小分子化合物,CYP2E1可被乙醇等小分子诱导。 为建立一种研究CYP1A2的体外检测系统,我们克隆CYP1A2野生型的cDNA到pYES2/CT穿梭表达载体上,测序证实其与CYP1A2*1A的cDNA序列一致;将重组质粒转入已经整合了细胞色素氧化还原酶（POR）基因的酿酒酵母中表达,免疫印迹分析筛选出.CYP1A2高表达菌株;裂解菌体后采用差速离心法制备酵母微粒体:并通过荧光检测法对所制备的微粒体进行酶活性检测,结果表明重组CYP1A2*1A有明显的催化活性,所得的数据可用非线性回归分析法计算Km值和Vmax值:用CYP1A2微粒体与其特异性抑制剂苯并黄酮（7,8-benzoflavon）进行抑制反应,并选取2C8、2C9、2C19、2D6、3A4的特异性抑制剂对所制备的微粒体CYP1A2*1A做比较抑制实验,结果显示除反苯环丙胺（Tranylcypromine）外,苯并黄酮对1A2*1A的抑制作用远高于其他CYPs的抑制剂,分析证实本研究建立的CYP1A2荧光药物筛选平台是可行的;采用7种抗抑郁药物进行荧光药物筛选实验,研究这些药物对我们用酵母表达系统获得的CYP1A2的抑制作用,本研究可为临床抗抑郁药物联合使用提供体外实验数据。 此外,本研究还建立了CYP2E1野生型酵母表达系统,通过测序证实其与CYP2E1*1A的cDNA序列一致,通过免疫印迹技术鉴定蛋白表达,为后续的药物筛选平台建立奠定基础。