毒性中药钩吻配伍玉叶金花减毒机制研究

目的探讨毒性中药钩吻配伍玉叶金花减毒机制,以阐明其减毒的科学内涵,为临床安全合理应用提供实验基础和理论依据。方法1.毒效相关性实验：采用小鼠急性毒性实验,以死亡率为指标,优选出钩吻的毒性提取溶剂、钩吻减毒的最佳配比、钩吻毒性部位及玉叶金花减毒部位；采用小鼠醋酸扭体实验、热板实验及福尔马林致痛实验,考察钩吻毒/效部位配伍前后的镇痛作用。2.对药物转运的影响：运用HPLC色谱法考察钩吻毒/效部位的稳定性；运用UPLC-MS/MS分析鉴定钩吻毒/效部位；建立Caco-2细胞转运模型,考察钩吻毒/效部位的双向跨膜转运及对P-糖蛋白(P-gp)及多药耐药相关蛋白2(MRP2)转运的影响。3.对药物转化的影响：采用反转录聚合酶链反应、蛋白免疫印迹、免疫组化等方法,分别考察钩吻配伍前后对Ⅰ相代谢中CYP2E1、CYP1A2基因与蛋白表达的影响；对Ⅱ相代谢中GST活力,GST-pi、GSTml基因与蛋白表达的影响。结果1.毒效相关性实验(1)减毒实验 ①提取溶剂的确定：随着乙醇浓度的增加,钩吻醇取物毒性逐渐增大,90%醇提物小鼠死亡率100%,故确定90%乙醇为其毒性提取溶剂。②减毒的配比优选：随着钩吻和玉叶金花配比的增加,死亡率下降,配比达1：40以上,死亡率不再降低,故选1：40为最佳配比,并验证其平均死亡率为23.33±5.78%。③相畏部位研究：钩吻90%醇提物的四个萃取部位(石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯及水部位)中二氯甲烷部位小鼠死亡率为100%,为其毒性部位；分别和玉叶金花的四个相应萃取部位配伍后,死亡率均有所下降,其中玉叶金花水部位死亡率最低,为其减毒部位,二者配伍后平均死亡率较配伍前大幅降低(P<0.05)。(2)镇痛实验 ①醋酸扭体实验：与生理盐水组比,钩吻配伍前后均能显著减少15min内醋酸所致的小鼠扭体次数(P<0.01),且配伍后镇痛率与剂量呈正相关。②热板实验：钩吻配伍前后在给药后30min的痛阈值与生理盐水组比均有显著性差异(P<0.05)；其中钩吻配伍高剂量组在给药后60min、90min内仍有显著性差异(P<0.05)。③福尔马林致痛实验：与生理盐水组比,钩吻配伍前后均使第Ⅱ时相内出现的疼痛反应持续时间显著减少(P<0.01)；钩吻组、钩吻配伍高、中剂量组使第1时相内出现的疼痛反应持续时间显著减少(P<0.01)。2.对药物转运的影响(1)转运前稳定性研究①HPLC色谱法稳定性分析：钩吻毒/效部位各色谱峰相对保留时间RSD为0.28%-0.91%,相对峰面积RSD为0.35%-4.02%,在48h内基本稳定；指纹图谱共有9个共有峰具有良好的重现性、稳定性和特征性,指纹图谱相似度大于0.93,具有很好的相关性。②UPLC-MS/MS鉴定分析：钩吻毒/效部位主要鉴定出6种吲哚类生物碱,分别为gelsemine、koumine、humantenidine、gelsenicine、 gelsevirine、humantenine。(2) Caco-2转运实验 ①双向跨膜转运：钩吻毒/效部位配伍后生物碱humantenidine、gelsenicine、gelsevirine、humantenine AP→BL方向的表观渗透系数Papp值均下降,BL-AP方向的Papp值均明显增加；生物碱humantenidine、gelsenicine、 gelsevirine外排比率γ均大于2,即外排明显。②对P-gp转运的影响：维拉帕米与钩吻毒/效部位合用后,6种吲哚类生物碱的吸收量、外排量均明显增加。维拉帕米与配伍后的钩吻毒/效部位合用后,生物碱humantenidine外排比减少了43.69%；gelsenicine外排比减少了41.42%；gelsevirine外排比减少了36.00%；humantenine外排比减少了8.90%。③对MRP2转运的影响：环孢素与钩吻毒/效部位合用后,6种吲哚类生物碱的吸收量、外排量均明显增加。环孢素与配伍后的钩吻毒/效部位合用后,生物碱humantenidine外排比减少了42.32%；gelsenicine外排比减少了40.59%；gelsevirine外排比减少了34.00%；humantenine外排比减少了15.07%。3.对药物转化的影响(1)对Ⅰ相代谢的影响 ①对基因表达的影响：与空白组比,钩吻毒/效部位各剂量组CYP2E1 mRNA表达量均极显著下降(P<0.01),配伍后表达量较高剂量上升(P<0.05)；与空白组比,钩吻毒/效部位各剂量组CYP1A2 mRNA表达量显著下降(P<0.05),配伍后表达有所上升,但无统计差异。②对蛋白表达的影响：WesternBlot法显示与空白组比,钩吻毒/效部位各剂量组CYP2E1蛋白表达均明显下降(P<0.05),配伍后表达量较高剂量上升(P<0.05)；与空白组比,钩吻毒/效部位高、中剂量组CYP1A2蛋白表达明显下降(P<0.05),配伍后表达量上升,但无统计差异。免疫组化法显示阳性染色细胞均呈棕黄色或棕褐色,与空白组比,钩吻毒/效部位各剂量组CYP2E1阳性细胞面密度、数密度均下降(P<0.01或P<0.05),配伍后较高剂量组上升(P<0.01或P<0.05)。与空白组比,钩吻毒/效部位各剂量组CYP1A2阳性细胞面密度均下降(P<0.01或P<0.05),配伍后较高剂量组上升(P<0.05)。(2)对Ⅱ相代谢的影响 ①对基因表达的影响：与空白组比,钩吻毒/效部位各剂量组GSTml mRNA表达量均极显著下降(P<0.01),配伍后表达量较高剂量上升(P<0.05)。与空白组比,钩吻毒/效部位高剂量GST-pi mRNA表达量显著下降(P<0.05),其它组间无统计差异。②对蛋白表达的影响：与空白组比,钩吻毒/效部位各剂量组GSTml蛋白表达均明显下降(P<0.05),配伍后表达量较高剂量上升(P<0.05)。与空白组比,钩吻毒/效部位各剂量组GST-pi蛋白表达均明显下降(P<0.05),配伍后表达量较高剂量上升,但无统计差异。③对酶活力的影响：与空白组比,钩吻毒/效部位各剂量组GST酶活力均明显下降(P<0.01或P<0.05),配伍后酶活力较高剂量上升(P<0.05)。结论1.钩吻二氯甲烷部位配伍玉叶金花水部位后既可降低毒性,又能保持镇痛药效。2.钩吻毒/效部位配伍后吲哚类生物碱在Caco-2细胞模型中的吸收减少,外排增加,其机制为可能存在P-gp、MRP2转运蛋白的诱导剂。3.钩吻毒/效部位配伍后上调了Ⅱ相代谢酶CYP2E1、CYP1A2的表达,增强了Ⅱ相代谢酶GST活性,达到减毒目的。