背景:胆汁郁积,指在肝细胞或胆管水平胆汁生成、分泌或流动障碍,导致胆汁不能正常进入十二指肠,而引起黄疸、皮肤瘙痒等症状的综合征。胆汁郁积性肝疾病十分常见,岭南地区发病率极高(如妊娠期肝内胆汁郁积发病率高达13%),其发病机制复杂,临床缺乏特效的治疗措施,严重威胁人们的健康,因此,防治该病刻不容缓。白花蛇舌草(Oldenlandia),为双子叶茜草科耳草属植物白花蛇舌草的带根全草,具有“清热解毒,清热利湿”的功效,在中医临床中被广泛应用于治疗痢疾,黄疸等症。但目前对于白花蛇舌草利胆、抗胆汁郁积作用及其机制尚无资料报道。本论文研究的主要内容和创新点主要是以多药耐药相关蛋白2(Multi-drug resistance protein-2,Mrp2)和胆汁盐输出泵(Bile salt export Pump,Bsep)为干预靶点,通过阐明白花蛇舌草醇提物(The alcoholic extract of Baihuasheshecao,BA)对Mrp2和Bsep的调节作用,为白花蛇舌草治疗胆汁郁积肝疾病提供理论与实验依据。目的:研究白花蛇舌草醇提物对肝Mrp2和Bsep的影响及其利胆作用。方法:1.观察大鼠灌服BA三个剂量,对胆汁排泄、肝功能、胆红素排泄、肝脏中Mrp2和Bsep的基因表达及其蛋白表达的影响。BA组(低、中、高剂量组)灌胃给予BA,对照组灌胃给予0.5%CMC-Na。末次药后30 min,腹腔注射20%乌拉坦(1.0 g/kg)麻醉大鼠,进行胆管插管手术,收集胆汁、全身血液和肝脏。测量胆汁体积,称量肝重,检测肝功能生化指标(丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP))、血浆中总胆红素(TB)和总胆汁酸(TBA)的含量及胆汁中TB、TBA和谷胱甘肽(GSH)的含量,并采用实时实时荧光定量RT-PCR检测肝脏中Mrp2和Bsep的基因表达水平及Western Blot和免疫组化测定其蛋白表达量的变化。2.尾静脉注射胆红素,观察大鼠灌服BA三个剂量后,测定胆红素的排泄。分组和给药方法同1。末次药后30 min,腹腔注射乌拉坦(1.0 g/kg)麻醉大鼠,进行胆管插管手术,尾静脉注射胆红素(20 mg/kg),然后按各时间点收集胆汁和血液,并收集尿液。检测胆汁、血浆和尿液中TB的含量。3.观察大鼠灌服BA三个剂量对α-异硫氰酸萘醋(α-naphthyl isothiocyanate,ANIT)造成急性肝内胆汁郁积模型的影响。模型组灌胃给予(60mg/kg)造成急性肝内胆汁郁积模型。模型+BA组(低、中、高剂量组)灌胃给予BA及灌服ANIT(60mg/kg)造模。模型+阳性对照组(熊去氧胆酸)灌胃给予熊去氧胆酸及灌服ANIT(60 mg/kg)造模。模型对照组灌胃给予花生油作为模型对照。各组大鼠末次药后30 min,腹腔注射20%乌拉坦(1.0 g/kg)麻醉大鼠,进行胆管插管手术,收集胆汁、全身血液和肝脏。测量胆汁体积,称量肝重,检测肝功能生化指标(ALT、AST、ALP)、血浆和胆汁中TB和TBA的含量、胆汁和肝脏中GSH的含量、肝脏组织的病理切片。4.观察大鼠灌服BA三个剂量对乙炔雌二醇(Ethinylestradiol,EE)造成慢性肝内胆汁郁积模型的利胆作用及对肝脏中Mrp2和Bsep的基因表达及其蛋白表达量的影响。模型组皮下注射EE(5 mg/kg)造成慢性肝内胆汁郁积模型。模型+ BA组(低、中、高剂量组)灌胃给予BA及皮下注射EE(5 mg/kg)造模。模型+阳性对照组灌胃给予熊去氧胆酸及皮下注射EE(5 mg/kg)造模。模型对照组皮下注射丙二醇作为模型对照。各组大鼠末次药后30 min,腹腔注射乌拉坦(1 g/kg)麻醉大鼠,其余操作同1。5.尾静脉注射胆红素,观察EE致慢性肝内胆汁郁积大鼠灌服BA三个剂量后,测定胆红素的排泄。造模和给药方法同4,末次药后30 min,腹腔注射20%乌拉坦(1 g/kg)麻醉大鼠,进行胆管插管手术,尾静脉注射胆红素(20 mg/kg),收集胆汁、尿液和血液。检测胆汁、血浆和尿液中TB的含量。结果:1.与对照组,BA组(低、中、高剂量组)显著促进胆汁排泄量和提高胆汁中TB、TBA、GSH的含量(P<0.01),肝比重、血浆中ALT、AST、ALP的含量均无明显变化(P>0.05)。在基因表达和蛋白表达水平上,与对照组比较,BA组(低、中、高剂量组)肝脏中Mrp2、Bsep基因和蛋白表达显著增强(P<0.01)。2.与对照组比较,在尾静脉注射胆红素实验中,BA组(低、中、高剂量组)显著加快胆红素的排泄(P<0.01)。3.在ANIT灌胃造成大鼠急性肝内胆汁郁积实验中,与模型对照组比较,模型组胆汁排泄量和胆汁中TB、TBA、GSH的含量均显著降低(P<0.01),肝比重显著增大(P<0.01),血浆中ALT、AST、ALP、TB、TBA的含量显著升高(P<0.01)。造模药后灌服BA(低、中、高剂量)组与模型组比较,前者显著增加胆汁排泄量(P<0.01),降低血浆中ALT、AST、ALP、TB和TBA的含量(P<0.01),以及显著提高胆汁中TB、TBA和胆汁、肝脏中GSH的含量(P<0.01),肝脏病理损害显著减轻。4.与模型对照组比较,模型组体质量(体重)显著下降(P<0.01),肝比重显著增大(P<0.01),胆汁排泄量和胆汁中TB、TBA、GSH的含量均减少(P<0.01),血浆中ALT、AST、ALP、TB、TBA的含量均显著增高(P<0.01)。与模型组比较,模型+BA组(低、中、高剂量组)体质量、胆汁排泄量及胆汁中TB、TBA、GSH的含量显著提高(P<0.01),血浆中ALT、AST、ALP、TB、TBA的含量显著降低(P<0.01)。在基因表达和蛋白水平上,模型+BA组(低、中、高剂量组)与模型组比较,模型+BA组(低、中、高剂量组)肝脏中Mrp2、Bsep基因和蛋白表达显著增强(P<0.01)。5.在尾静脉注射胆红素实验中,与模型对照组比较,模型组胆红素的排出显著减少(P<0.01)。模型+BA组(低、中、高剂量组)与模型组比较,前者在相同时间内,血浆中、胆汁中和尿液中胆红素的排出增加(P<0.01)。结论:BA通过上调肝Mrp2和Bsep的表达,促进胆汁流和减少肝内胆汁酸及其他代谢产物在肝脏中的蓄积,表现了其保肝利胆、抗胆汁郁积的作用。
